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陆生植物气生器官的表皮覆盖着一层由蜡质形成的脂膜,它主要由特长链脂肪酸的衍生物组成.表皮蜡质的物理化学性质决定它在植物的生活史中起着重要的作用.作为物理屏障,蜡质可以限制非气孔性失水、抵御过量紫外线照射引起的损伤、抵抗细菌和真菌等病原菌的入侵.虽然目前对于蜡质的合成和调节途径还没有定论,但是已经提出许多模式用来解释蜡质的合成与运输途径.
植物表皮蜡质的生物合成及分泌途径在各种植物中是相当保守的.首先是质体中的脂肪酸从头合成,生成C16或C18饱和脂肪酸;然后是在内质网上的延长及各种衍生物的合成;最后穿过质膜、细胞壁、角质膜到达细胞表面.目前只是通过分析已经分离到的几种酶和多种植物的蜡质突变体,来推测其合成和分泌途径.不论是在质体内还是在内质网上,脂肪酸的延长过程是由相似的四步反应循环进行的:缩合、还原、脱水、还原,不同之处只是酰基载体的不同,质体内为ACP,内质网上为辅酶A,反应每循环一次,酰基链增加两个碳原子.内质网上的脂肪酸衍生途径有两条:酰基还原途径(生成一级醇、酯、可能有醛)和脱羰途径(生成醛、烃、二级醇、酮).
表皮蜡质的主要成分都由链长在20-32碳的特长链饱和脂肪酸衍生出来.脂肪酸的延伸包括4个酶促反应,它由4种酶催化:KCS,KCR,DCH、ECR.KCS催化了由丙二酰辅酶A到长链酰基辅酶A的过程,这是特长链脂肪酸合成(VLCFAs)的限速步骤,它决定了生成特长脂酰链的链长.在拟南芥中,已经研究的有四个KCS:单一缩合酶FAE1,催化种子中特长链脂肪酸的合成:KCS1、FDH、CER6已被证明参与了蜡质成分的合成.
盐芥与拟南芥近缘,在遗传特征和生活习性上与拟南芥相似,如:小的基因组,短的生活史,都是自花授粉,有丰富的种子等;同时,相比拟南芥,盐芥又有很多自身的优势,如更强的耐性和有更为丰富的表皮蜡质等.因此,盐芥是一种很有前景的植物蜡质研究材料.用新基因组学方法研究盐芥,可以鉴定和克隆在拟南芥中无明显性状的有价值的基因,特别是参与植物表皮蜡质合成的基因.
本论文分别从植株整体发育状态、SEM观察表皮蜡质形态、GC-MS分析蜡质成分及含量方面研究了春化前后山东、Yukon、新疆三种生态型盐芥型盐芥(Thellunmgiella halophila)表皮蜡质的差异.结果证明春化前三种生态型盐芥没有明显的差异,叶表面光滑:4℃低温处理4周后新生莲座叶和茎生叶表面都具肉眼可见白色蜡质.扫描电镜结果和GC-MS结果都显示低温处理后具白芒叶表面蜡质的总含量有大量增加,其中C29烷烃显著增加.SEM结果显示山东型盐芥茎生叶表皮蜡质最丰富,新疆型总含量稍低,但与山东型相差不大,Yukon型最少.蜡质成分分析与SEM结果证明特长链脂肪酸衍生物成分的增多,会引起蜡质晶体形态的明显改变,使晶体柄部增大,晶体颗粒变大.应用实时荧光定量PCR技术,我们研究了蜡质合成过程中与VLCFAs碳链延伸相关的KCS家族21个基因在不同发育时期山东型盐芥中的表达,结果显示其中61.9﹪的基因在茎生叶中比在成熟莲座叶(16周莲座叶)中的表达量高,表明这些基因的表达与蜡质成分的生成成正相关.虽然盐芥较拟南芥表面有丰富的蜡质,但这些基因表达模式与拟南芥相仿,85﹪的基因与拟南芥已有的研究有相仿的表达趋势.推测可能与启动子微调或miRNA微调有关,也可能与基因转录后修饰,如甲基化修饰有关.此21个基因在三种生态型盐芥20周茎生叶中的ReaLl-time PCR结果显示,KCS家族中47.6﹪的基因在三种生态型盐芥中表达量相仿.33.3﹪在山东型盐芥中表达最高,其中有五个基因在山东和新疆型中表达相仿,都高于Yukon中的表达.
在拟南芥中,对FDH家族中的Atlg07720基因未有较深的研究,本实验中用pGSA1252载体将盐芥中与Atlg07720同源的基因进行基因沉默,以进一步观察其表型及用荧光定量PCR测其家族中其它基因的表达,研究同一基因家族中各基因之间的关系.