论文部分内容阅读
草莓是无性繁殖的多年生草本植物,生产中病毒危害严重,有效的研究病毒的分离方法和基因组解析具有重要意义。本研究旨在建立草莓病毒的dsRNA分离方法,获得草莓主要病毒的部分基因组序列,主要结果如下: 1.利用汁液摩擦接种技术,成功地将草莓病毒从草莓栽培品种转移到昆诺藜上,并表现出明显的斑点症状,RT-PCR检测确已感染SMoV和SMYEV。 2.比较不同的dsRNA提取方法,结果表明:提取过程中使用酸性酚容易使草莓组织褐化,影响提取核酸的纯度和质量,而碱性酚能够有效地保持核酸的活性;传统的SDS法提取的病毒dsRNA量很少,且不易研究DNase Ⅰ、RNase A和两次过柱对dsRNA含量的影响;CTAB法提取的病毒dsRNA质量较差,谱带多呈现弥散状态;本研究改进的SDS法,可以成功地从草莓病毒指示植物和栽培品种的叶片中提取出病毒dsRNA,能够稳定地进行琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR检测及克隆测序研究。 3.比较了SYBR和EB两种荧光染料的染色效果发现,SYBR的检测灵敏性比EB至少高2倍,但SYBR染色的谱带前移和变形明显,不能准确地反映提取的病毒dsRNA的大小。 4.从出现斑点症状的昆诺藜叶片和染病的草莓植株叶片中成功地提取了草莓病毒的dsRNA,但多次提取从昆诺藜叶片中仅获得了1条2kb左右的dsRNA谱带,而直接从草莓植株中提取的病毒dsRNA则主要集中在5~7kb。 5.通过提取草莓不同栽培品种、不同培养方式、不同叶片成熟度中的病毒dsRNA发现,不同草莓品种中病毒dsRNA的含量不同,试管苗叶片中dsRNA含量高于露地苗幼叶,而露地苗幼叶中dsRNA含量明显高于完全成熟叶。 6.为有效去除dsRNA提取物混杂的DNA和ssRNA,通过DNase Ⅰ和RNase A进行酶解处理,比较了不同的酶解时间、缓冲液中盐离子浓度,结果发现:dsRNA在0~0.7mol·L-1 NaCl浓度下,对DNase Ⅰ均具有很强的耐性;当酶解缓冲液中含0.5 mol·L-1 NaCl以上时,dsRNA对RNase A具有较强的耐性;适宜的酶解处理方法为:先进行DNase Ⅰ处理,盐离子浓度0 mol·L-1,处理时间120min;经沉淀之后再进行RNase A处理,盐离子浓度0.5 mol·L-1,处理时间60min。 7.利用TaKaRa公司的DNA凝胶回收试剂盒,能够有效回收凝胶中的dsRNA片段。