论文部分内容阅读
真核生物的多数pre-mRNA通过拼接选择性外显子产生不同的成熟mRNA亚型，这些mRNA剪接亚型可以翻译具有不同生物学功能的蛋白亚型或者直接在RNA水平发挥调控作用。以往研究选择性剪接多关注于RNA pol II、DNA结合蛋白以及相关剪接因子的调节作用。但是，近年来发现选择性剪接也受表观遗传学修饰调节，机制包括：染色质重塑、组蛋白修饰以及DNA甲基化。自然反义转录本(natural antisense transcripts,NATs)，是位于编码基因反义链上的DNA序列产生的内源性RNA。根据其与正义编码基因的位置关系，分头对头（5’to5’）、尾对尾(3’to3’)、以及完全重叠(full overlap)三种方式。自然反义转录本与正义转录本反向互补，可能在DNA修饰、转录、转录后加工、RNA的稳定性与降解等多个层面发挥对正义基因的表达调控作用。 白细胞共同抗原CD45（亦称为PTPRC）是一种跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，特异表达于无核的血细胞中，具有激活酪氨酸激酶去磷酸化活性，在细胞信号转导通路中发挥作用。CD45基因可转录CD45 RA、CD45 RB、CD45 RC以及CD45 RO等多种剪接亚型，这些亚型标志着淋巴细胞的不同功能状态，并与临床一些免疫相关疾病的发病以及病情进展相关。 系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一种自身免疫性相关的结缔组织疾病，患者外周血中CD45 RA亚型明显要低于正常人，且外周血中CD45 RA/RO亚型可作为其疾病的特异标记物。 为研究反义转录本对正义基因CD45选择性剪接的调控作用和作用机制，并探讨其与临床免疫疾病SLE的相关性，本研究：（a）PCR克隆CD45基因的自然反义转录本，并通过佛波酯（PMA）处理人白血病细胞株U937细胞，建立CD45剪接亚型差异性表达的细胞模型，并利用实时定量PCR检测CD45反义转录本与正义各亚型表达量之间的关系。（b）RNAi下调CD45反义转录本的表达量，观察反义转录本对正义CD45剪接亚型表达量的影响。（c）U937细胞knockdown CD45反义转录本后，采用甲基化特异性PCR检测CD45基因DNA的甲基化状态，以探索反义RNA对正义基因表观遗传学的修饰作用。（d）收集临床SLE患者外周血标本，提取RNA，经实时定量PCR分析CD45反义转录本在临床疾病中与正义CD45各种亚型表达量以及SLE发病及疾病进展之间的关系。 实验结果显示CD45反义转录本的表达量与CD45 RO亚型表达具有正相关性，干扰CD45反义转录本可特异性降低CD45 RO亚型表达，提示CD45反义转录本的表达与正义CD45外显子剪接跳读存在相关性。同时，甲基化特异性PCR结果显示干扰CD45反义转录本可导致正义DNA序列的甲基化水平增加，提示反义RNA可能通过DNA甲基化在表观遗传学水平调控正义基因的选择性剪接。PMA处理U937细胞可调节CD45基因选择性剪接模式，促进CD45 RO亚型表达，并呈现CD45 RARO亚型转变的现象。SLE患者外周血标本结果显示CD45反义转录本与SLE患者异常CD45 RO亚型的相关，提示CD45反义转录本有可能作为一种治疗靶点逆转或改善SLE患者体内淋巴细胞异常状态。