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哺乳动物中,RFRP-3可在垂体促性腺细胞水平或GnRH神经元水平抑制促性腺激素的合成与分泌,RFRP-3也是目前已知的唯一抑制生殖的下丘脑神经肽。尽管大量研究已经证实RFRP-3功能的重要性,但其作用靶细胞的分子机制尚未完全阐明,特别是很少有研究证实RFRP-3对青春期的启动是否起到决定性作用。因此,本研究在高通量测序、生物信息学分析基础上,应用分子生物学手段从体内、体外阐明RFRP-3调控哺乳动物生殖发育的分子机制。具体研究主要体现在以下几个方面:（1）明确RFRP-3对雌性小鼠青春期的发育及启动的作用。本研究通过侧脑室注射外源RFRP-3多肽、以及RFRP-3过表达慢病毒,探究RFRP-3对雌性小鼠青春期前期生殖发育的生理学作用。RT-qPCR和免疫组化研究结果显示RFRP-3多肽和慢病毒颗粒注射都抑制了下丘脑GnRH mRNA和蛋白水平,也显著抑制了下丘脑kiss1/GPR54基因的表达。RFRP-3多肽和RFRP-3过表达均显著抑制了血清中LH和E2的分泌,而青春期前期卵巢切除消除了RFRP-3对LH分泌的抑制作用,在成熟小鼠中卵巢切除则未改变RFRP-3的抑制作用。这表明RFRP-3对促性腺激素分泌的抑制作用与雌激素状态和发育阶段相关。此外,解剖学结果显示,RFRP-3慢病毒注射显著抑制了小鼠子宫内膜的厚度和卵巢初始卵泡的数量。这些研究结果表明:RFRP-3可直接或间接作用GnRH神经元来抑制GnRH/LH的激增,从而抑制青春期的启动,进而在性腺的发育与成熟中发挥重要的生理学作用。（2）垂体细胞中探究RFRP-3调控促性腺激素分泌的分子机制。目前RFRP-3对促性腺激素分泌的抑制作用发生在垂体水平还是下丘脑水平尚存在争论。本研究在垂体瘤细胞株LβT2细胞中探究RFRP-3调控促性腺激素分泌的分子机制。结果显示:外源激素和RFRP-3过表达对基底促性腺激素分泌并无显著影响,但均以时间和剂量依赖性抑制GnRH诱导的促性腺激素的分泌。根据KEGG信号通路分析结果显示GnRH处理激活了GnRH信号通路里PKA和PKC信号通路。PKA拮抗剂H89和PKC拮抗剂GF预处理发现,H89和GF均减弱了RFRP-3对GnRH诱导的促性腺激素分泌的抑制作用,这表明该抑制作用效果可能通过PKA和PKC联合调节的ERK信号通路发挥生理学效应。上述研究结果表明RFRP-3在垂体水平对促性腺激素分泌的抑制作用依赖于GnRH,可能通过作用于GnRH调节的PKA/PKC信号通路调控促性腺激素的合成和分泌。（3）下丘脑细胞中探究RFRP-3调控GnRH分泌的分子机制。本研究在下丘脑GnRH神经元GT1-7细胞系探究RFRP-3调控GnRH分泌的信号转导途径,发现:无论是外源性激素,还是RFRP-3基因过表达,均能够显著抑制GnRH的转录和蛋白的合成与分泌。通过高通量测序数据,利用生物信息学分析,结果显示,RFRP-3处理下调了cAMP信号通路、MAPK信号通路以及GnRH信号通路等信号通路的活性。根据KEGG数据库分析我们推测RFRP-3可能通过cAMP/PKA/ERA信号通路抑制GnRH的分泌。在细胞水平利用不同级联信号通路抑制剂和RFRP-3联合处理验证这一假设。H89预处理减弱了RFRP-3对GnRH分泌的抑制作用,然而GF处理对其抑制作用并无明显影响,这进一步证实RFRP-3通过抑制PKA调节的ERK信号通路抑制Gn RH的合成和分泌。此外,本研究还证实RFRP-3与雌激素信号通路和kisspeptin信号通路之间相互作用相互联系。结果显示,三者之间相互促进,以不同的信号途径共同调控GnRH的合成与分泌。本研究从多角度系统的验证了RFRP-3调节雌性小鼠生殖发育的分子机制。哺乳动物中,RFRP-3通过其受体GPR147激活Gai,从而抑制/cAMP/PKA调节的ERK信号通路,进而直接抑制GnRH的合成和分泌。GnRH分泌进入垂体门静脉系统,在垂体水平调控促性腺激素的分泌,从而调控性腺的发育与性激素的合成与分泌,调控哺乳动物青春期的发育和启动以及生殖功能。