表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种糖蛋白,该蛋白的过表达与肺癌、头颈部癌、乳腺癌、前列腺癌以及结直肠癌等肿瘤的增殖及转移密切相关,Cetuximab是一种人-鼠嵌合抗EGFR单克隆抗体,能特异性靶向人表皮生长因子受体,阻断EGFR信号通路。虽然该抗体在结直肠癌的治疗中取得了良好的疗效,但在非小细胞肺癌的治疗中与单纯化疗相比并没有显著性差异。近期,采用抗体药物阻断PD-1/PD-L1信号通路在肿瘤治疗的临床前与临床实验中取得了突破性进展,Science、Nature和Cell等杂志大篇幅详细介绍了借助PD-1/PD-L1阻断性抗体,能够改变肿瘤免疫微环境,进而能够更加有效杀伤肿瘤细胞。临床试验结果显示,通过抗体阻断PD-1/PD-L1通路在NSCLC中表现出良好的治疗效果。目前,美国FDA已批准Atezolizumab用于NSCLC的临床治疗。虽然抗体药物已经广泛用于临床肿瘤治疗,但是由于肿瘤发生、发展过程的复杂性和多因素性决定了,仅仅依靠单一靶向的单克隆抗体药物,大部分患者在临床治疗过程中会逐渐产生耐受和复发。因此,亟待提高肿瘤靶向抗体的疗效。双靶向抗体由于其能够特异性识别多个靶点,其在杀伤肿瘤中的优势逐渐被研究人员所认识,在抗肿瘤治疗过程中显示出优势。与此同时,一大批双靶向抗体药物正在进行临床试验,但双靶向EGFR与PD-L1的双特异性抗体药物的研究目前仍未有人报道。如何设计出针对NSCLC具有更好疗效的新型抗体药物是本课题研究的一个重点。本课题的研究目的:通过计算机辅助设计优化抗体结构,利用crossmab技术,构建同时能够靶向EGFR和PD-L1的双特异性抗体,期望得到更为有效的治疗非小细胞肺癌的靶向药物。本课题的研究方案:1.将EGFR单抗Cetuximab和PD-L1单抗Atezolizumab作为亲本抗体,构建EGFR/PD-L1双特异性抗体,其不仅具有类似天然IgG抗体的Y型结构,而且能够同时靶向EGFR和PD-L1分子;2.利用FreeStyle 293-F Cells哺乳动物表达体系,表达EGFR/PD-L1双特异性抗体,并对其进行纯化以及利用Western-blot技术对得到的抗体蛋白进行鉴定;3.利用EGFR-PD-L1 CrossMab,进行与靶细胞结合能力以及直接介导细胞死亡活性的体外研究实验。本课题的研究结果:1.利用“knobs-into-holes”技术(即“杵臼”技术)和“crossover”技术(即“交叉”技术)构建EGFR/PD-L1 CrossMab抗体,分别构建了 C225H-knob/cmv、C225L/cmv、RG74H-CL-FChole/cmv、RG74LV-CH1/cmv 四条真核表达载体;2.将 C225H-knob/cmv、C225L/cmv、RG74H-CLFChole/cmv、RG74LV-CH1/cmv四条真核表达载体瞬时共转染FreeStyle 293-F Cells, 7天后收集细胞上清并纯化得到目的蛋白,即EGFR-PD-L1 CrossMab.利用SDS-PAGE对得到的蛋白进行鉴定。结 论:本实验成功构建了能够同时靶向EGFR和PD-L1的双特异性抗体,即EGFR-PD-L1 CrossMab,并初步对 EGFR-PD-L1 CrossMab 进行了 验证。