论文部分内容阅读
研究背景:卵泡的正常发育是维持女性性激素分泌及成熟卵子形成的基础,卵泡闭锁过多、过快则导致卵泡过早耗竭、卵巢早衰。研究证实颗粒细胞凋亡是引发卵泡闭锁的重要原因。颗粒细胞凋亡受到多种机制调控,叉头蛋白O1(Forhead boxO1,FoxO1)可启动死亡通路中Fas配体(Fas ligand,FasL)表达,是促进颗粒细胞凋亡的重要基因。氧化应激可通过促进FoxO1蛋白核转运诱导颗粒细胞凋亡,卵泡发生闭锁,然而氧化应激导致FoxO1入核的调节机制不清。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类广泛表达的非编码小RNA,参与调控细胞增殖、分化、凋亡等生理病理活动。我们前期通过芯片分析发现miR-181a在卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)患者血清中表达显著升高,且miR-181a在小鼠生长卵泡中水平较初级卵泡中明显减少,我们还发现过表达miR-181a通过靶向抑制激活素受体2A表达,阻断激活素A促进颗粒细胞的增殖作用。那么,miR-181a是否参与颗粒细胞凋亡的调控呢?研究目的:本文主要探索氧化应激诱导表达的miR-181a在颗粒细胞凋亡过程中的调节作用。研究方法:(1)入选40例POF患者和20例生育能力正常育龄妇女,采用血清miRNA提取试剂盒提取血清中miRNA,通过qRT-PCR检测miR-181a表达水平;(2)体外培养人卵巢肿瘤颗粒细胞系KGN细胞和原代小鼠颗粒细胞(mouse granulosa cell,mGC),给予不同浓度或不同时间双氧水(hydrogen peroxide,H2O2)刺激,检测 miR-181 a 表达变化;(3)Ad-miR-181a 感染(25 或 50 MOI)或 miR-181 a inhibitor 转染(100 nM)KGN 或 mGC,采用 qRT-PCR、细胞凋亡 ELISA、Western blot等实验,检测miR-181a对颗粒细胞凋亡的调控作用;(4)KGN或mGC中过表达miR-181a或干扰内源性miR-181a,通过Western blot和细胞免疫荧光实验探索miR-181 a通过蛋白翻译后修饰调控FoxO 1核质转移的调控机制;(5)KGN或mGC中过表达miR-181a或干扰内源性miR-181a,荧光素酶报告基因、qRT-PCR和Western blot等实验证实miR-181a对SIRT1的靶向调节作用;(6)H2O2、Ad-miR-181a 结合 Ad-h-SIRT1 处理 KGN 或 mGC 后,细胞凋亡 ELISA 或Western blot调查SIRT1在H2O2和miR-181a诱导颗粒细胞凋亡过程中的保护作用。研究结果:(1)卵巢早衰患者血清中miR-181a水平较生育能力正常同龄妇女中含量升高约3.68倍(P<0.01);H2O2以浓度梯度和时间梯度依赖的方式促进人和小鼠卵巢颗粒细胞中miR-181a的表达;腺病毒Ad-miR-181a感染KGN细胞或mGC,以浓度梯度依赖的方式增加细胞中断裂DNA的产生,并增加凋亡标志分子caspase 3活化;干扰内源性miR-181a表达,H2O2诱导的caspase 3活化被显著抑制。(2)miR-181a和H2O2刺激,可以明显增加颗粒细胞中促凋亡分子FoxO1在细胞核中的定位,并显著诱导FoxO1靶分子FasL的蛋白水平和下游凋亡分子Bax和caspase 3活化水平;基因沉默颗粒细胞中内源性FoxO1表达后,miR-181a促caspase 3活化被显著削弱;进一步机制研究发现,过表达miR-181a对颗粒细胞中FoxO1蛋白的磷酸化修饰(S256和S319)影响不明显,但乙酰化修饰显著增强;干扰miR-181a表达后则可削弱H2O2促FoxO1蛋白的乙酰化修饰作用。(3)KGN和mGC中过表达miR-181a抑制人与小鼠SIRT1 3’UTR报告基因活性约70%(P<0.01);Western blot 和 qRT-PCR 实验进一步证实 miR-181a 抑制 KGN 细胞和mGC中SIRT1蛋白和mRNA的表达;功能补偿实验则证实在腺病毒介导的KGN细胞中SIRT1过表达,可明显减少H2O2和miR-181a促FoxO1蛋白的乙酰化修饰作用,并抑制H2O2和miR-181a诱导颗粒细胞中凋亡通路的活化;给予KGN细胞和mGC SIRT1激动剂3(SA3)刺激,可以削弱miR-181a促进的FoxO1蛋白乙酰化,并明显抑制颗粒细胞凋亡。研究结论:miR-181a在卵巢早衰患者血清中异常高表达,且在颗粒细胞中表达受H2O2上调;miR-181a通过靶向抑制SIRT1的表达,增加FoxO1乙酰化修饰及细胞核转运,导致颗粒细胞凋亡。本研究首次发现miR-181a介导FoxO1蛋白乙酰化修饰参与颗粒细胞凋亡的调控作用。