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本试验研究了黑熊耳部成纤维细胞的原代培养方法,并对黑熊成纤维细胞冷冻保存的冷冻保护剂和冷冻方法进行了筛选,探讨了处理后成纤维细胞对黑熊-牛克隆胚体外发育的成活影响,为建立黑熊-牛的克隆胚发育体系,促进黑熊-牛后代发育率,可为制作克隆动物、异构胚动物提供技术,为实验室的大局发展,学弟学妹的研究提供理论依据。所得结果如下：1.试验为了获得黑熊成纤维细胞系,将黑熊耳边缘皮肤组织块进行冷冻,并与未冷冻组织块比较。结果为：未冷冻组织块培养5d后开始游离细胞,细胞成活率为75%：冷冻组织块复苏后培养6d开始有细胞游离,细胞活率为68.7%。2.选用不同density的三种冷冻保护剂：二甲基亚砜(DMSO:5、7.5、10、12.5%)、乙二醇(EG：10、15、20、25%)、甘油(GC；C:5、10、15、20%))对黑熊成纤维细胞进行冷冻,结果为DMSO浓度为7.5%对黑熊耳部成纤维细胞冷冻效果最好。3.黑熊成纤维细胞分别在-70℃和-196℃下冻存一周、一个月、三个月,复苏后检验细胞活率发现-70℃一周活率较高,-196℃一周、一个月、三个月活率无差异。4.用MTT检测未冷冻和冷冻复苏后3-6、7-9、10-12代组细胞活力,结果为,未冷冻与冷冻复苏后3-6代组无差异、7-9代、10-12代组差异显著。5.使用正常培养的黑熊耳皮肤成纤维细胞的3-6、7-9、10-12代组分别进行供核,结果为7-9代黑熊成纤维细胞为最佳供体细胞代数,且异种重构胚发育率最好。6.分别将黑熊耳皮肤成纤维细胞的3-6、7-9、10-12代组用7.5%的DMSO进行冷冻保存,冷冻复苏后的3-6代、7-9代和10-12代组成纤维细胞为供体,其卵裂率、多细胞胚发育率、桑葚胚发育率无显著差异(P>0.5),但是7-9代组略好于其他两组。