研究背景：银屑病是一种常见的慢性、复发性、炎症性、免疫紊乱性疾病,全世界银屑病的患病率为1～4%左右。本病主要侵犯青壮年,临床上分为寻常型、脓疱型、关节病型及红皮病型银屑病4种类型,其中寻常型银屑病是临床最多见的类型,临床表现主要为红色丘疹、斑块,表面覆盖有程度不等的白色鳞屑,除皮损外,患者尚可出现代谢综合征的相关表现,近年来大量的流行病学调查研究表明银屑病,尤其是关节型银屑病与高同型半胱氨酸血症、高脂血症、动脉粥样硬化、肥胖症和糖尿病等代谢性疾病有关,从而严重影响患者的生活质量,给患者带来极大的身体和心理上的痛苦。由于该病反复发作,常需反复治疗,因而给患者及其家庭带来沉重的经济负担。故其对患者的身体健康和精神影响甚大,是当前皮肤科领域内重点研究的疾病之一,对银屑病的发病机制进行深入的探讨意义重大。银屑病的主要病理改变为表皮角化过度伴角化不全,真皮乳头毛细血管增生、扩张,炎细胞显著浸润。其确切病因和发病机制尚未清楚,目前认为,银屑病是遗传因素与环境因素等多种因素相互作用的多基因遗传病,多数研究表明银屑病的发生与免疫功能紊乱有一定的关系,免疫细胞和细胞因子对角质形成细胞的增生和分化、毛细血管增生、扩张均有一定的作用。因此,对其进行分子免疫学的研究在疾病的诊断、判断病期、预见转归、寻找新的免疫治疗药物方面有着十分重要的应用价值和学术价值。目前研究表明有40多种激素、生长因子、细胞因子和生物活性物质参与调节角质形成细胞的增殖和分化,数种信号传导系统参与了这一调节过程。目前多数学者认为银屑病是一种T细胞介导的自身免疫性疾病。国外研究结果表明在银屑病皮损区,激活的T细胞产生一系列细胞因子,包括IFN-γ、 IL-1、6、8及TNF等,这些细胞因子与角质形成细胞表面相应受体结合后,可能引起角质形成细胞内角蛋白表达模式的改变。Janus激酶(Janus kinases,JAKs)是一种蛋白酪氨酸激酶,信号转导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STATs)是JAKs的直接底物,能将信号传递到核内,调节特定基因的表达,二者构成JAK/STAT信号转导通路。在角质形成细胞中,JAK/STAT信号转导途径在银屑病的发病中起重要作用,而STAT转导机制的准确作用尚不完全清楚,似乎有抗增殖和促分化的作用,但不同类型的作用有待进一步明确。JAK/STAT是一条是继Ras途径之后出现的又一重要的细胞因子信号转导通路。该通路的激活是多数细胞因子发挥其生物效应最普遍且最重要的细胞内信号传导通路。细胞因子能与靶细胞上相应的受体相结合,通过JAK/STAT通路将信号由细胞膜传至细胞质并最终传至细胞核,而发挥多种生物学效应。研究表明,JAK/STAT途径参与人体内生理和病理反应,与多种疾病的发病及防治密切相关。细胞因子激活JAK,后者磷酸化STAT,经磷酸化而活化的STAT移位到细胞核,与特定的DNA元件结合,发挥其生物活性。STAT蛋白是一类胞浆蛋白,参与多种细胞因子和生长因子的信号传导。到目前为止,在哺乳动物中已分离、克隆出7种STATs基因和蛋白：STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b和STAT6,其中STAT1和STAT2的组织分布最广。现证实STAT1、STAT3的异常活化可以促进细胞的分化增殖,抑制细胞的凋亡,从而导致多种疾病的发生1997年发现的细胞因子信号转导抑制物(Suppressor of cytokine signaling, SOCS)被认为是JAK/STAT信号系统的主要负调节机制。其中SOCS1、 SOCS3是最重要、最主要的细胞因子信号转导抑制物,也是目前SOCS家族中研究比较清楚的。SOCS蛋白是多数细胞因子受体信号传导的重要调节剂,它们通过负反馈方式调节细胞因子启动的JAK/STAT信号传导通路。其作用机制包括：与JAK结合而抑制其激酶活性,竞争性抑制STAT与活化受体的结合而抑制STAT的激活,以及介导信号蛋白依赖蛋白酶体的降解过程。银屑病是一种与免疫功能紊乱有关的疾病,异常激活的T细胞产生一系列细胞因子,后者可能引起角质形成细胞内角蛋白表达模式的改变。其中,IFN-γ与角蛋白K17表达的关系已明确,IFN-γ可激活STAT1,多个STAT结合到K17基因启动子(promoter),诱导表皮基底层以上部分角质形成细胞表达角蛋白K17,另外有许多因子(如IL-3、粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子、IL-6等)通过一个共同的信号转导机制参与了这一过程的调控。细胞因子类受体本身缺乏酪氨酸激酶活性,其信号传递必须借助细胞内JAKs家族完成,后者又通过激活STATs,影响最终的基因转录调节。此外,研究显示在银屑病发病过程中,银屑病皮损浸润的T淋巴细胞分泌的IFN-γ,其本身的抗增殖和诱导分化作用对银屑病皮损的角质形成细胞不敏感是因为IFN-γ受体信号途径的异常。IFN-γ受体(IFN-γR)信号途径中STAT1的磷酸化影响到最终的基因转录调节。病变的角质形成细胞中STAT1活性降低,影响到受其调节的IFN-γ调节因子1的活性,使异常增殖的角质形成细胞对IFN-γ作用不敏感,造成银屑病表皮生长失控[6-13]。基于上述研究结果,JAK/STAT信号转导途径在银屑病发病中作用值得研究。研究目的：1、收集银屑病患者皮损区和非皮损区的部分组织,并从该组织中分离出角质形成细胞。2、用实时荧光定量PCR法分别检测各皮损区和非皮损区角质形成细胞中STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3基因mRNA的表达。3、探讨角质形成细胞中STAT1、STAT3、SOCS1和SOCS3基因的表达与银屑病发病的关系,推测JAK/STAT信号传导途径及其负性调节因子(SOCS)在银屑病发病中的作用及意义。4、探讨银屑病STAT与其负性调节因子SOCS之间的相互关系,进一步研究银屑病的发病机制。研究方法：1、研究对象：具有银屑病典型皮损并经病理确诊,临床上处于进展期即：新皮疹不断出现,皮疹不断扩大,颜色鲜红,鳞屑较薄,炎症明显,周围有炎性红晕,痒感较显著；取材前1个月内未系统使用糖皮质激素、免疫抑制剂、维A酸类药物及其他治疗药物,1个月内末外用治疗银屑病的药物；无其他系统疾患。符合以上条件的患者共10例。2、采用手术取材法收集上述银屑病患者皮损区和非皮损区部分组织,分别去除皮下组织、留下表皮层和真皮层。3、将标本剪成8mm×3mm大小,PBS清洗3次,加入1.6U/mL dispase中4℃消化过夜,第2天剥离出表皮并将其保存在冻存管中备用以抽取RNA。4、抽取组织总RNA,并以紫外分光光度计检测各RNA样本的0D260/280值,判定RNA的纯度(即分别在波长260nm与280nm下测定RNA样本的吸光度A260和A280,并计算A260/A280比值,A260/A280≥1.8为纯度合格),并计算RNA浓度。另取适量RNA在1%琼脂糖凝胶和1×TAE电泳液中电泳(电压100V)20min,通过凝胶成像分析仪观察RNA的电泳图像,如果见较为清晰的28S与18S条带,说明RNA样本质量较好。符合上述条件的RNA置-80℃冰箱备用。5、引物设计及合成：检索NCBI GenBank数据库,所设计引物分别针对不同的外显子,以三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作为内参对照的校准基因。应用Primer Premier5软件设计STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3和GAPDH的PCR引物。6、逆转录合成cDNA将提取的总RNA按TaKaRa PrimeScript II1st Strand cDNA Synthesis Kit (D6210A)试剂盒说明书逆转录合成cDNA。7、实时荧光定量聚合酶链反应：PCR反应体系总体积20u L,包括cDNA2.0μL, dH206.4μL, SYBR(?) Premix Ex TaqTM (2×)10.0μL,10μmol/L上下游引物各0.8pL。在CFX96荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR。各基因每个标本做3个复孔,扩增条件采用二步法：95℃,10min预变性,1个循环；95℃,10s,变性,60℃,20s,退火,72℃,30s,延伸,共44循环。计算各标本平均Ct值,以GAPDH作为内参,将STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3Ct值减去GAPDH Ct值作为ACt值。8、采用SPSS13.0软件进行数据统计分析,数据以x±s表示。作方差齐性分析和t检验。变量间的相关关系用Pearson相关分析,所有检验以P<0.05为差异为统计学意义。结果：1、银屑病皮损区组和非皮损区组候选基因mRNA的表达水平：银屑病患者皮损区组角质形成细胞STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3基因mRNA的表达水平显著高于非皮损区组,均P<0.01。2、角质形成细胞STAT1、STAT3基因mRNA的表达与SOCS1、SOCS3基因mRNA的表达的相关性：银屑病患者角质形成细胞STAT1mRNA的表达水平ACt值与SOCS1、SOCS3mRNA的表达水平ACt值呈显著的正相关(r=0.787、0.843,均P<0.01)：而角质形成细胞STAT3mRNA的表达水平ACt值与SOCS1、SOCS3mRNA的表达水平ACt值也呈显著的正相关(r=0.843、0.829,均P<0.01)。结论：1、银屑病患者皮损区组角质形成细胞STAT1、STAT3基因mRNA的表达水平显著高于非皮损区组,提示Jak/STAT信号传导通路可能参与银屑病的发病。推测Thl细胞分泌的这些细胞因子与角质形成细胞膜上相应的受体结合后活化Jak,进而磷酸化其下游信号蛋白分子STAT,后者识别并结合靶基因DNA特异的反应元件,调节靶基因的转录,从而促进银屑病皮损的形成。2、银屑病患者皮损区组角质形成细胞SOCS1、SOCS3基因mRNA的表达水平显著高于非皮损区组,且银屑病患者角质形成细胞STAT1、STAT3mRNA的表达水平分别与SOCS1和SOCS3mRNA的表达水平呈显著的正相关,推测细胞因子激活Jak/STAT信号传导通路、触发银屑病皮损发生发展的同时,也诱导角质形成细胞生成SOCS1、SOCS3并抑制细胞因子进行Jak/STAT信号传导通路的信息胞内传递,起到抑制银屑病发病的作用。3、银屑病角质形成细胞内STAT1、STAT3和SOCS1、SOCS3的表达水平可能是治疗银屑病的潜在药物作用靶点。4、下一步实验将应用RNA干扰技术,沉默STAT1和STAT3,观察JAK/STAT信号传导通路有关蛋白的表达变化及银屑病患者角质形成细胞的功能变化,进一步证实该信号传导通路在银屑病发病中的作用。