研究背景肿瘤的发生及发展是一个多步骤且极其复杂的生物学过程,其中涉及细胞增殖与抗凋亡,细胞周期调节,血管生成,细胞分化,细胞侵袭及转移等诸多因素,并且这些因素是相互关联和相互影响的。血管生成在肿瘤增殖与转移过程中起到重要作用,抑制血管生成可以抑制并阻止肿瘤的发展和扩散转移。血管生成起始于肿瘤细胞释放生长相关因子,传达信号于血管内皮细胞。该过程涉及多种调节蛋白的相互作用,包括促血管生成刺激,内皮细胞激活、增殖和迁移。一些重要的血管生成因子包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor, VEGFR)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等,抑制血管生成相关因子的激活能够有效地抑制肿瘤血管形成。因此,抑制血管生成是肿瘤治疗的重要策略。端粒酶是一种逆转录酶,由核糖核酸(Ribonucleic acid, RNA)和蛋白质组成的核糖核蛋白体。它以自身的RNA作为端粒脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)复制模版,合成富含dGMP的DNA序列后,添加到染色体末端,并与端粒蛋白结合,保护染色体免于降解、端端融合、重排和丢失,维持染色体的稳定性和完整性。端粒酶在多数正常细胞中不表达或低表达,而在90%的肿瘤细胞中过度表达。因此,端粒酶被认为是肿瘤细胞的标志物,已经成为肿瘤药物设计与治疗的靶点。Riccardin D是从苔藓类植物Dumortiera hirsuta分离所得的一种新型双联卞类化合物。前期研究表明,Riccardin D具有抑制肿瘤增殖作用,Riccardin D能在体内外抑制多种肿瘤细胞生长。Riccardin D能显著降低APCmin+基因小鼠小肠息肉及腺瘤的数量,表明Riccardin D具有化学预防和治疗作用。基于前期研究结果,本研究观察Riccardin D对肿瘤血管生成及端粒酶活性等方面的抑制作用,并探讨其主要作用机制。1 Riccardin D对肿瘤微血管生成的抑制作用实验方法：以人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)为靶细胞,以MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dip-henyl tetrazolium bromide,溴化-(4,5)-二甲基-2-噻唑基-2,5-二苯基四噻唑)法检测了Riccardin D对HUVEC细胞增殖的抑制作用。以划痕法检测了Riccardin D对HUVEC细胞迁移能力的影响。以3D Matrigel管形成法检测Riccardin D对血管生成的抑制作用。以Western blot法检测]Riccardin D对HUVEC细胞中与血管生成相关蛋白VEGF、p-VEGFR2、EGFR、MMP-2表达水平的影响。以Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR,逆转录聚合酶链反应)法检测Riccardin D对HUVEC细胞中VEGF、p-VEGFR2、EGFR、MMP-2 mRNA表达水平的影响。以RT-PCR法检测Riccardin D对人非小细胞肺癌H460细胞中VEGF mRNA表达水平的影响。将裸鼠接种人非小细胞肺癌H460细胞,20 mg/kg Riccardin D尾静脉注射给药3周,每3天一次,20 mg/kg Etoposide作为阳性对照药物,评价Riccardin D对非小细胞肺癌H460生长的抑制作用。将瘤块取出后,以免疫组织化学方法,检测肿瘤组织中CD34表达水平,评价Riccardin D对肿瘤血管生成的抑制作用。实验结果：Riccardin D对HUVEC细胞的增殖具有一定的抑制作用,呈现时间和剂量依赖性的作用特点。以2.5-30μM Riccardin D作用HUVEC细胞,其抑制率为2.2%至28.5%。划痕实验表明,Riccardin D能有效地抑制HUVEC细胞迁移。作用12 h及24 h后,Riccardin D对HUVEC细胞的迁移抑制率分别为95.0%和97.7%。Western blot和RT-PCR实验均显示,Riccardin D显著降低HUVEC细胞中EGFR、VEGF、p-VEGFR2和MMP-2表达水平。Riccardin D也能抑制非小细胞肺癌H460细胞中VEGF mRNA表达。3D Matrigel结果显示,Riccardin D能有效抑制：HUVEC细胞形成毛细血管。以5、10、20μM Riccardin D与HUVEC细胞孵育18 h,对于新生微血管分支形成的抑制率分别是78.7%、59.0%、29.5%。H460荷瘤裸鼠模型结果显示,20 mg/kg Riccardin D抑制肿瘤生长率为44.5%,裸鼠体重无明显下降。免疫组织化学实验结果表明,Riccardin D明显抑制肿瘤组织CD34表达水平,肿瘤组织中血管密度降低。实验结论：Riccardin D具有抑制肿瘤微血管生成的作用。2 Riccardin D对肿瘤细胞端粒酶活性的抑制作用实验方法：选用人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231,以TRAPeze(?)XL端粒酶活性检测试剂盒法,检测Riccardin D对肿瘤细胞端粒酶活性影响。以Western blot及RT-PCR方法,检测]Riccardin D对肿瘤细胞及肿瘤组织中端粒酶活性关键蛋白hTERT蛋白表达及mRNA表达的影响。以Western blot及RT-PCR法,检测Riccardin D对肿瘤细胞端粒保护蛋白TRF2蛋白表达及mRNA表达影响。以免疫荧光染色及Western blot法,检测Riccardin D对肿瘤细胞DNA损伤标志分子γ-H2AX的影响。以Western blot法,检测Riccardin D对DNA损伤信号通路蛋白p-ATM、p-Chk2表达的影响。采用MTT法,检测Riccardin D对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖的影响。通过建立裸鼠移植人乳腺癌细胞MCF-7和]MDA-MB-231-D3H2LN肿瘤模型,评价Riccardin D对乳腺癌生长抑制作用。以异硫氰酸荧光素(Annexin V-fluoresceine isothiocyanate, FITC)/PI双染、Western blot及原位末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法,研究Riccardin D对肿瘤细胞凋亡的诱导作用,对poly(ADP)ribose polymerase (PARP)、bax/bcl-2、cysteine-aspartic acid proteases (Caspase)-3、Caspase-9等的调节作用。以流式细胞术及Western blot法,测定Riccardin D对人乳腺癌细胞周期及p53、p21等表达水平的影响。实验结果：TRAPeze(?) XL端粒酶活性检测显示,Riccardin D以剂量依赖性作用方式下调MCF-7和MDA-MB-231细胞端粒酶活性。Western blot显示,Riccardin D显著抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞及肿瘤组织中hTERT蛋白表达。RT-PCR显示,Riccardin D显著抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞中hTERT mRNA表达。Western blot及RT-PCR显示,Riccardin D下调MCF-7和MDA-MB-231细胞TRF2蛋白及mRNA表达水平。免疫荧光染色及Western blot显示,Riccardin D作用后,MCF-7和MDA-MB-231细胞中γ-H2AX损伤灶形成增加,γ-H2AX蛋白表达升高。Western blot显示,Riccardin D上调p-ATM、p-Chk2表达,激活DNA损伤信号通路。MTT显示,Riccardin D对人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231具有显著抑制作用,呈现剂量和时间依赖性关系。MCF-7和MDA-MB-231-D3H2LN荷瘤裸鼠模型结果显示,20 mg/kg Riccardin D对MCF-7肿瘤生长抑制率为47.2%,对MDA-MB-231-D3H2LN肿瘤生长抑制率38.5%,裸鼠体重无明显下降。AnnexinV-FITC/PI显示,20μM Riccardin D作用48 h,诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡率分别为32.0%和22.1%。Western blot显示,Riccardin D提高人乳腺癌细胞PARP、Caspase-3、Caspase-9裂解活化程度及bax/bcl-2比例。流式细胞术显示,Riccardin D将MCF-7细胞(p53-proficient)周期阻滞于G1期,MDA-MB-231细胞(p53-deficient)周期阻滞于G2/M期。Western blot显示Riccardin D上调MCF-7细胞p53和p21表达水平。实验结论：Riccardin D下调MCF-7和MDA-MB-231细胞端粒酶活性,致端粒功能失调,激活DNA损伤应答反应,从而诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞。综上所述,Riccardin D具有抗肿瘤作用,明显抑制肿瘤细胞生长。Riccardin D通过多种途径发挥抗肿瘤作用,包括抑制肿瘤血管生成,抑制肿瘤细胞端粒酶活性,从而激活DNA损伤应答途径,诱导肿瘤细胞凋亡及细胞周期阻滞。