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新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的一种急性病毒性传染病，对养禽业造成巨大的危害。NDV属于副粘病毒科、禽腮腺炎病毒属成员。NDV是单股负连RNA病毒，基因组全长15186、15192或15198bp，其基因结构为3’Leader-NP-P-M-F-HN-L-5’Trailer,分别编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白。虽然NDV只有一个血清型，但是根据F基因或全基因的遗传分型，可把新城疫病毒分为两大类，Class I和Class II。Class I由基因IIX型组成，Class II由基因IXI型组成。NDV的宿主范围较广，除家禽外，还可感染约240种野生鸟类。野鸟作为新城疫病毒的自然储存库，在新城疫病毒遗传、进化及毒力的演变过程中发挥着非常重要的作用。作者实验室于2008年从陕西秦岭北麓野鸟身上分离出两株新城疫病毒，一株来源于乌鸫（Eurasian Blackbird），一株来源于珠颈斑鸠（Spotted-necked dove）。前期的实验表明这两株病毒为基因Ⅸ型，不同于国内在家禽中流行的基因Ⅶd亚形的毒株。这两株毒株HN基因序列的相似性较高均为99%以上，但这两株毒株的1日龄雏鸡颅内接种指数（Intracerebral pathogenicity index，ICPI）差距较大，分离于乌鸫的毒株的ICPI值为1.638，而珠颈斑鸠的仅为0.425。因此，研究这两株NDV的致病性、测定病毒的全基因组，研究病毒的及构建野鸟源NDV的反向遗传系统，将对NDV的遗传进化及毒力的研究提供重要的信息。本研究以实验室08年分离于陕西秦岭山脉野鸟的两株NDV（Blackbird/China/08和SpottedDove/China/08）为研究材料，从病毒的致病性入手，结合病毒的全基因组信息，分析了新城疫病毒的遗传进化和影响病毒毒力的主要因素，并构建了一株分离株的全长cDNA，为后续NDV反向遗传系统的构建、病毒机理的研究及疫苗的研发奠定了基础。主要结果如下：1.本研究中两株纯化的野鸟源新城疫病毒的ICPI（intracerebral pathogenicity index）值差距较大：Blackbird/China/08为1.55，达到强毒株的标准；SpottedDove/China/08为0.425，符合弱毒株对应的ICPI值的范畴。攻毒后1日龄小鸡的死亡率，Blackbird/China/08也明显高于SpottedDove/China/08，Blackbird/China/08组的小鸡在攻毒后的第六天全部死亡，而SpottedDove/China/08组直到第三天才有两只小鸡死亡，最后总共死亡3只。Blackbird/China/08在DF-1细胞上增殖的能力强于SpottedDove/China/08，在感染细胞的12小时后，细胞培养液中Blackbird/China/08的滴度为1.1×105PFU/mL，而SpottedDove/China/08的仅为7.0×103PFU/mL。Blackbird/China/08在DF-1细胞上的促细胞融合能力和使细胞病变的能力也强于SpottedDove/China/08,在感染细胞的24小时后，Blackbird/China/08形成的合包体中细胞核的个数明显多于SpottedDove/China/08，且感染Blackbird/China/08的细胞病变比SpottedDove/China/08的明显。2.本研究通过RT-PCR （Reverse Transcriptional PCR）的方法，测定了两株野鸟源新城疫病毒的全基因组列，其全基因长度都为15192bp。全基因序列分析发现，两株病毒F蛋白的裂解位点为112R-R-Q-R-R-F117，HN蛋白的氨基酸残基数为571个，L蛋白的功能域为746CMVQGDNQVI755，V蛋白的C端含有保守的7个半胱氨酸残基。两株病毒的全基因序列对比，发现两株病毒的同源性高达99.9%，全基因只有17个核苷酸不同，编码的结构蛋白中9个氨基酸有差异，其中2个分别位于P蛋白的77位和105位氨基酸残基，1个位于M蛋白的16位，3个分别位于HN蛋白的110、468和522位，3个分别位于L蛋白的1076、1728和1876位。全基因和部分F基因的遗传进化分析，表明这两株野鸟源的新城疫病毒属于基因Ⅸ型的毒株，且和其它基因Ⅸ型和基因Ⅲ型NDV强毒株的亲缘性较高，其全基因的同源性达到91.7%99.8%。3.本研究通过对融合PCR的退火温度、延伸时间、反应体系等条件的摸索，建立了一种改进的融合PCR方法，并成功地构建了一株野鸟源新城疫病毒的全长cDNA，为后续病毒反向遗传系统的建立打下了基础。酶切克隆的方法需要数天甚至数月才能构建好新城疫病毒的全基因组，而利用该研究建立的融合PCR方法不仅可以节约昂贵的高保真、高扩增效率的DNA聚合酶，而且可以在两天内成功的构建新城疫病毒的全基因组，大大的缩短了反向遗传系统建立所需的时间，为疫苗研发特别是突发传染性疾病的疫苗研发提供一种快捷的途径。