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几丁质及其衍生物经几丁质酶降解,产生一些几丁寡糖,能止血抗凝、抗肿瘤转移、降低血压,促进有益微生物(如双歧杆菌)生长;还能激活巨嗜细胞,诱导细胞因子产生,提高机体免疫力;另能刺激成纤维细胞增殖,有利于胶原沉积,与细胞外基质成分结合,促进组织修复。此外,几丁寡糖还有抗菌防腐、保水保湿等功效。在医药、化妆品等行业具有广泛的开发前景。
本研究的目的是探索利用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌系统来表达来自于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因。本文通过PCR的方法从苏云金芽孢杆菌的染色体上扩增得到几丁质酶基因chiA,通过测序鉴定与报道的苏云金芽孢杆菌konkukian亚种的几丁质酶基因的序列完全一致。分别构建表达载体pET-28a-chiA和pHSG-chiA,将它们分别在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达。通过酶活的测定在两种重组菌中都检测到了酶活。同时对重组芽孢杆菌所产的重组酶的酶学性质作了初步的研究。重组酶的最适作用温度大约在50℃,30℃-60℃为酶的稳定温度范围,同时将酶60℃保温30min,仍然保持约80%的酶活力。最适作用pH约7.0,酶的稳定pH范围为4-8。考察发现pET-28a-chiA在大肠杆菌中稳定性较好,而对于芽孢杆菌表达载体pHSG-chiA在传代过程中发生质粒丢失的现象,无选择压力下连续转接5次,几乎全部发生丢失。
对重组菌的发酵条件进行了初步的优化,分别考察了碳源、氮源、培养基初始pH、装液量、接种量以及诱导时机对产酶的影响。得到了最终的优化培养基,其成分为:几丁质2%,酵母膏2.5%,NaCl1%,K2HPO40.1%,MgSO4·7H2O0.01%,调节初始pH为8.0,装液量为250mL摇瓶加入培养基20mL培养基,接种量10%,诱导时机选择在培养4h后,加入IPTG诱导,继续培养8h测定酶活。通过优化后酶活可以提高到4.8U/mL。