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小麦白粉病和赤霉病是世界小麦生产中的严重病害。南京农业大学细胞遗传所培育出高抗白粉病的小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系，其携有高抗白粉病基因Pm21。研究并克隆小麦抗病基因，对控制小麦病害及研究小麦抗病的分子机理有非常重要的意义。本研究利用植物抗病基因具有一些共同的保守区如核苷酸结合位点（NBS），富含亮氨酸重复（LRR）和丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶域的特点，设计简并性引物通过PCR方法获得抗病基因片段，继而筛选6VS/6AL易位系的可转化人工染色体（TAC）基因组文库，分离完整的基因。 用根据NBS，LRR和丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶域设计的3对简并性引物，以6VS/6AL易位系的基因组DNA或cDNA及簇毛麦的基因组DNA为模板进行PCR扩增。扩增产物克隆到pGEM-T载体中，经测序，共获得具有NBS结构域片段的克隆18个，具有LRR结构域片段的克隆3个，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶域片段的克隆1个。将克隆之间核苷酸序列同源性高于90％的克隆归为一类，共分为8类。这8类抗病基因类似序列（RGAs）均具有开放阅读框，并与已克隆的小麦抗条锈病基因Yr10，大麦抗白粉病基因Mlal和Mla6，拟南芥的抗病基因RPS2，番茄的抗病基因Cf-2、Cf-4、Cf-5和Cf-9以及其他一些抗病基因在保守区内具有高度的同源性。用小麦中国春缺体-四体初步将它们分别定位于小麦第一、第二和第五部分同源群上。 根据从小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系的基因组DNA获得的一条296bp的LRR序列设计引物，以6VS/6AL易位系的基因组DNA为模板，用TAIL-PCR从两端延伸该片断达800bp左右。根据该序列设计了一对特异引物，分别以感病对照扬麦5号，抗病6VS/6AL易位系，6V代换系，硬粒小麦-簇毛麦双二倍体及簇毛麦的基因组DNA为模板进行特异性扩增。除扬麦5号未扩出带，其他均扩出一条730bp的带。再用不同品系小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系以及其他品种的基因组DNA为模板进行PCR，都只能在含有Pm21的易位系中扩出730bp的目的带，而不含Pm21的品种则无扩增产物。 用克隆池PCR法用这对LRRt的特异引物筛选小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系的基因组TAC文库。该文库由22块96孔板组成，每孔中含有约1000个混合的TAC克隆。为了用PCR筛选文库，首先提取这22×96个混合质粒，然后用特异引物分级筛选，最后获得一个可能的阳性TAC单克隆。将该TAC克隆用不同6碱基酶酶切，转膜后，以上述LRR片段作探针进行Southern杂交，每种酶切均有杂交带，表明该克隆为真正的阳性单克隆。其中用SeaⅠ酶酶切的该TAC克隆，仅在约4．okb处有一条杂交带。将这条带进行亚克隆后，用特异引物分步测序，共获得 273 hp序列。 该序列编码一个含有753个氨基酸的蛋白，暂命名为7iiLKKIo用出 刀软件在GeneBank中比较该基因的核昔酸序列，未发现有明显同源的序列，表明该基因是一个新基因。当用BbotZ、0软件在GeneB毗中比较该基因的氨基酸序列时，发现TaLRRI与番茄抗病垦因CfJ、o人q5和o9以及其他一些抗病基因在保守区内具有高度的同源性。再用 ClustaIXI．巴软件将 TaLRRI的氨基酸序列与番茄抗叶霉病基囚 CfZ和 Cf4的氨基酸序列进行多序列比较，结果表明 TaLRRI与 CfZ和 Cf4有相似的结构。这是首次从小麦中克隆到的与双于叶植物番茄的 CfJ和 Cf4有类似结构的细胞外受体类抗病候选基因。根据比较结果推断TaLRRI为一个含有LRR的膜结合糖蛋白，可划分为7个区域（AAI）。A区是可能的信号肽，B区是成熟蛋白的N－端，C区为25个LRR重复，D区是没有明显特点的区域，E区富含带负电荷的酸性氨基酸的区域，F区由29个不带电荷的氨基酸组成跨膜疏水区，G区富含带正电荷的碱性氨基酸的区域。C区共有13个可能的糖基化位点N以S汀卜 用电激转化法将该TAC克隆转人农杆菌LBA4404中。从农杆菌中提取质粒，再转入大肠杆菌，再从人肠杆菌提取质粒，然后用Hedll酶切，酶切带型与原未的该TAC质粒完全一样，哀明该TAC质粒可以在农杆菌中稳定存在。用该克隆转化小麦的实验正在进行中。 本研究获得的RGA序列之一N7与小麦抗条锈病基因bIO和大麦抗口粉病基因M7dj及ABiz6分别有65o和61o的核芍酸相似性，并具有R基囚NBS保守区。用N7的特异引物筛选6VS／6AL易位系的基因组TAC库，获得一个抗病候选基因的TAC克隆。 小麦抗赤霉病性状山数量基因控制，遗传机制复杂。利用抗赤霉病品种苏麦39和望水IJ，分别与感病品种Alondra’s杂交，取n代花药培养获得单倍体绿苗。绿茁转接到炼茵培养基上在4℃冰箱中越夏。初冬移栽大田。分孽期挖出小苗，用0．04％的秋水仙碱浴液浸根加倍。并用玉米和小麦杂交通过染色体捎除法获得小麦单倍体。共获得能稳定遗传的双单倍体群体（DH 2个。其中来自苏麦 3号 X Alondra’s的群体共有 102个株系，来自望水白 x Alondra’s的群体共有153个株系。在构建DH群体时对一些影响小麦单倍体获得效率的囚素进行了初步研究。