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第一部分CXCL12基因重组腺病毒的构建及鉴定目的:构建趋化因子CXCL12(c-x-c motif chemokine ligand 12)重组腺病毒表达载体,为后续试验打下基础。方法:将目的基因CXCL12全长c DNA模板进行PCR扩增、酶切后与p HBAd-MCMV-GFP载体结合,获得p HBAd-MCMV-CXCL12-GFP载体(Ad-CXCL12)。QPCR和ELISA检测Ad-CXCL12转染MSCs后细胞中CXCL12表达水平。结果:PCR及测序结果证实CXCL12重组腺病毒载体构建成功。QPCR及ELISA结果显示Ad-CXCL12转染MSCs后能促进细胞中CXCL12表达。结论:构建含CXCL12基因的重组腺病毒,其转染MSCs后能稳定高效的表达CXCL12,可用于后续试验中。第二部分Runx2基因转染MSCs后对其迁移信号轴CXCL12/CXCR4的影响目的:观察Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor-2,Runx2)基因过表达对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外迁移能力的影响。方法:分离培养兔MSCs,用已构建携带Runx2基因的腺病毒载体(Ad-Runx2)、单纯腺病毒及AMD3100处理MSCs,应用Transwell小室检测MSCs体外迁移能力变化,QPCR检测趋化因子CXCL12(c-x-c motif chemokine ligand 12)及趋化因子受体(Cys-X-Cys receptor 4,CXCR4)m RNA表达,ELISA检测各组细胞培养液上清中CXCL12含量,Western blot检测CXCR4蛋白表达水平。结果:Ad-Runx2转染MSCs组细胞迁移数明显增多(p<0.01),AMD3100处理MSCs后细胞迁移数明显降低(p<0.01)。QPCR及ELISA、Western blot结果显示:Ad-Runx2转染能促进MSCs中CXCL12及CXCR4表达(p<0.01)。结论:Runx2基因过表达能促进MSCs体外迁移,这与其激活CXCL12/CXCR4信号轴相关。第三部分CXCL12基因转染MSCs后对其成骨分化的影响目的:用趋化因子CXCL12(c-x-c motif chemokine ligand 12)重组腺病毒转染间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)后检测其对MSCs成骨分化信号轴BMP2/Smad/Runx2/Osterix及成骨标志基因表达的影响。方法:将构建的p HBAd-MCMV-CXCL12-GFP载体(Ad-CXCL12)转染MSCs。QPCR和Western blot检测Ad-CXCL12转染MSCs后细胞中CXCL12表达水平。用Ad-CXCL12、Ad-GFP、AMD3100(CXCL12特异性阻断剂)处理MSCs,72 h后检测成骨分化信号轴BMP2/Smad/Runx2/Osterix表达。转染1周后检测ALP活性,2周后检测BSP、OCN、OPN基因表达水平,3周后行矿化结节染色晚期成骨能力。结果:72 h后,Ad-CXCL12转染组细胞中Runx2及Osterix、Smad1/5/8的m RNA表达水平及蛋白表达水平较其它各组明显提高,比较有显著性差异(p<0.01);1周后,Ad-CXCL12转染组细胞总蛋白中ALP活性明显高于其它各组,比较有显著性差异(p<0.01);2周后,Ad-CXCL12转染组BSP m RNA水平升高,比较有显著性差异(p<0.01);OCN及OPN m RNA表达水平未见明显变化,比较无显著性差异(p>0.05);3周后,Ad-CXCL12转染组细胞矿化结节染色可见各组间无明显差异(p>0.05)。结论:CXCL12基因转染可在早期促进MSCs向成骨细胞分化,而在MSCs向成骨细胞分化的中后期无明显影响。