背景：骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一种严重危害中老年人身心健康的退行性关节疾病,主要病理变化为关节软骨的磨损及退变,临床上常出现关节疼痛反复发作、关节活动障碍而且不断加重等症状。关节软骨主要包括软骨细胞(chondrocyte)和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)两种组分。整体而言,软骨细胞的凋亡以及ECM合成分解和代谢平衡的紊乱是关节软骨退变的主要表现,也是OA发病的主要病理特征。ECM的主要成分有水、胶原、蛋白聚糖和糖蛋白等。胶原组分能够相互作用构成一个巨大的纤维网,是支持软骨基质的主要结构支架,其中最重要的胶原成分是Ⅱ型胶原(collagen type Ⅱ),约占总胶原含量的90-95%。蛋白聚糖能够在关节软骨组织中生成较强的膨胀压力,在水合过程中具有重要的意义。由此看出,保证ECM的结构及功能的完整性是维持关节软骨正常生理功能的重要条件。作为关节软骨中唯一的一种细胞成分,软骨细胞的主要功能在于维持ECM的合成与分解代谢稳态。软骨细胞能够大量地生成和分泌胶原、蛋白多糖等ECM基础结构组成成分；同时,软骨细胞也能够不断地生成和分泌多种基质降解酶、蛋白多糖降解酶及其他各种水解酶,从而降解消化变性、功能异常的ECM蛋白,破坏ECM的结构,所以说软骨细胞的凋亡或着软骨细胞的生理功能异常都会极大改变ECM代谢的动态平衡,改变关节软骨结构和功能的完整性,这是促发OA发生的重要原因之一。由此可知,软骨细胞的凋亡与ECM结构与功能的完整性密切相关,细胞凋亡可以促进ECM的分解代谢,而ECM的降解也可以促进软骨细胞的凋亡。作为软骨组织的主要成分,软骨细胞和ECM二者相辅相成,共同调控着关节软骨的正常生理功能。目前,OA的发病机理仍不清楚,针对软骨细胞的损伤进行研究对于阐明OA的发病机制有重要意义,为OA的预防及干预治疗提供理论依据。MicroRNAs (MiRNAs)是一种普遍存在于真核生物中的单链RNA分子,一般长度约为17～25 nt。MiRNA可能存在于基因组的各个区域,例如基因的间隔区、编码基因的内含子区。但是无论miRNA来自何处,其加工成熟的机制是基本相同的,成熟miRNA的生成需要经历以下多个步骤。首先miRNA基因被转录成为初级转录物,称之为pri-miRNA。然后pri-miRNA经过第一次加工,形成包含70 nt左右的miRNA前体,称之为pre-miRNA。随后pre-miRNA经过第二次加工被剪切成包含21-25 nt的成熟miRNA。MiRNA的表达受到机体的精细调控,具有组织特异性、时空特异性等特征,往往它们的异常表达就会引起癌症、心血管等多种疾病的发生。目前关于miRNA表达的机制研究了解较浅,其中转录方面的调控是影响miRNA表达的一个重要方式,例如p53,作为一个转录因子,有报道证明它能够通过调控转录过程来影响miRNA的表达。在进化过程中,miRNA是高度保守的,它能够通过碱基互补配对的方式直接靶向目的基因的mRNA,直接降解该基因或者是抑制其翻译过程,从而干扰靶基因的表达。MiRNA的靶基因众多,人体内大约含有2万个基因,而miRNA能够调控约三分之一的基因。另外,一个miRNA的靶基因往往不止个,而一个靶基因也可能会受到几个miRNA的调控。MiRNA参与调控许多生命活动,例如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和器官发育等。目前研究表明,miRNA在OA的发生与发展进程中有非常重要的意义。目的：本研究旨在探讨miR-502-5p在正常和OA软骨组织中的表达水平差异,进而研究miR-502-5p对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的生物学作用及其作用机制,为OA疾病探寻新的治疗靶点并提供新的理论依据。方法：第一部分的工作是关于miR-502-5p在OA软骨组织中的表达及其生物学作用的研究。首先,用RT-PCR方法检测了四个预测的miRNAs (miR-502-5p、miR-138、miR-205、miR-146a)在20组正常和OA软骨组织中的表达水平差异。用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶联合消化法分离培养正常的软骨细胞,然后作不同处理,分为四组：对照组,正常培养的软骨细胞；IL-1β组,用IL-1β处理的软骨细胞；miR-502-5p mimic组,转染miR-502-5p mimic后再用IL-1β诱导软骨细胞；阴性对照组,转染miR-502-5p negative control后再用IL-1β诱导软骨细胞。RT-PCR方法检测不同处理组miR-502-5p的表达水平差异。MTT方法检测不同处理组的细胞增殖水平。流式细胞仪检测不同处理组的细胞凋亡水平。Western blot方法检测不同处理组凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达水平。RT-PCR和western blot方法检测不同处理组促炎因子IL-6、TNFa和IL-8的表达水平。RT-PCR和western blot方法检测不同处理组ECM结构蛋白蛋白聚糖和Ⅱ型胶原、金属蛋白酶MMP-3、MMP-9和MMP-13的表达水平。第二部分的工作是关于Wnt/β-catenin信号通路与miR-502-5p-p53调控回路关系的研究。RT-PCR和western blot方法检测了p53在20组正常和OA软骨组织中的表达水平差异。分离培养正常的软骨细胞,首先探究p53对miR-502-5p的调控作用,对软骨细胞作不同处理后分为四组：对照组,正常培养的软骨细胞；IL-1β组,用IL-1β处理软骨细胞；si-p53+IL-1β组,转染p53 siRNA,再用IL-1β诱导软骨细胞；阴性对照组,转染p53 negative control,再用IL-1β诱导软骨细胞。western方法检测不同处理组p53的蛋白表达水平差异。RT-PCR检测不同处理组miR-502-5p的表达水平差异。然后构建miR-502-5p启动子的荧光素酶报告载体,荧光素酶报告实验研究p53对miR-502-5p的转录调控作用。然后探讨miR-502-5p对p53的调控作用,将细胞随机分为四组：对照组、IL-1β组、miR-502-5p mimic组和阴性对照组。RT-PCR和western blot方法检测不同处理组p53的蛋白表达水平。构建p53 3’-UTR的荧光素酶报告载体,荧光素酶报告实验研究miR-502-5p对p53的调控作用。进一步探究Wnt/β-catenin信号通路对p53的调控作用。RT-PCR和western blot方法检测了Wntl、Wnt3a和P-catenin在20组正常和OA软骨组织中的表达水平差异。胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶联合消化法分离培养正常的软骨细胞,作不同处理,分为三组：对照组即正常培养的软骨细胞；IL-1β组,用IL-1p处理软骨细胞；Wnt3a抑制剂组,加入sFRP-3和Dkk-1,再用IL-1p处理软骨细胞。western blot方法检测Wnt3a、 P-catenin和p53的蛋白表达水平。第三部分的工作是关于miR-502-5p的靶标基因及相关通路的研究。RT-PCR和western blot方法检测了TRAF2在20组正常和OA软骨组织中的表达水平差异。胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶联合消化法分离培养正常的软骨细胞。构建TRAF23’-UTR的荧光素酶报告载体,荧光素酶报告实验研究miR-502-5p对TRAF2的调控作用。分离培养正常的软骨细胞,随机分为四组：对照组、IL-1β组、miR-502-5p mimic组和阴性对照组。RT-PCR和western blot方法检测不同处理组TRAF2的蛋白表达水平。随后探讨miR-502-5p是否通过靶向调节TRAF2介导NF-κB信号通路。分离培养正常的软骨细胞,作不同处理,分别五组：对照组,正常培养的软骨细胞；IL-1β组,IL-1β处理软骨细胞；PDTC组,加入NF-κB抑制剂PDTC后再用IL-1β处理软骨细胞；si-TRAF2+IL-1β组,转染TRAF2 siRNA后再用IL-1β处理软骨细胞；miR-502-5p mimic组,转染miR-502-5p mimic,再用IL-1β处理软骨细胞。Western blot方法检测不同处理组NF-κB和IκB-α的蛋白表达水平。MTT方法检测不同处理组的细胞增殖水平。流式细胞仪检测不同处理组的细胞凋亡水平。Western blot方法检测不同处理组促炎因子IL-6、TNFα和IL-8的表达水平。Western blot方法检测不同处理组ECM结构蛋白蛋白聚糖和Ⅱ型胶原、金属蛋白酶MMP-3、MMP-9和MMP-13的表达水平。结果：第一部分结果表明miR-502-5p在OA软骨组织中的表达下调,且发挥重要的生物学作用。与正常对照组相比,OA软骨组织中miR-502-5p的表达显著下调。IL-1β处理软骨细胞使miR-502-5p的表达显著下调。miR-502-5p mimic的转染使miR-502-5p表达明显提升。与对照组相比,IL-1β组的细胞增殖率下降；细胞凋亡率显著增加；抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下调,凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达显著上调；IL-6、IL-8和TNFα的mRNA和蛋白表达水平显著上升；Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达显著下调,而MMP-3、MMP-9和MMP-13等金属蛋白酶的mRNA和蛋白表达显著上调。与IL-1β组相比,miR-502-5p mimic组的细胞增殖率有显著上调；凋亡率显著降低；抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著上调,而凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达显著下调；IL-6、IL-8和TNFα的mRNA和蛋白表达水平显著下降；Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达都有显著升高,而MMP-3、MMP-9和MMP-13的mRNA和蛋白表达显著下降。第二部分结果表明Wnt/β-catenin信号通路通过调控p53,进而调控miR-502-5p的表达。与正常对照组相比,OA软骨组织中p53的mRNA和蛋白表达水平显著上调,而且p53与miRNA-502-5p的表达呈负相关关系。与对照组相比,IL-1β组p53的蛋白表达水平显著上调；miR-502-5p的表达水平显著下降；miR-502-5p启动子活性显著降低。与IL-1β组相比,si-p53组p53的蛋白表达显著降低；miR-502-5p的表达水平显著升高；miR-502-5p的启动子活性显著上升。与对照组相比,IL-1β组p53的nRNA和蛋白水平显著升高;pGL3-p533’-UTR的荧光素酶活性无显著变化；与IL-1β组相比,miR-502-5p mimic组p53的蛋白水平显著降低,而mRNA水平无显著差异；pGL3-p53 3’-UTR的荧光素酶活性无显著变化。与正常对照组相比,OA软骨组织中Wnt蛋白Wnt1和Wnt3a的表达显著上调,β-catenin的表达水平也显著上调。与对照组相比,IL-1β组Wnt3a、β-catenin和p53的表达水平上调；miR-502-5p的表达水平显著下降。与IL-1p组相比,Wnt3a抑制剂组Wnt3a、β-catenin和p53的表达水平均显著下调；miR-502-5p的表达水平显著升高。第三部分为miR-502-5p的靶基因TRAF2及TRAF2介导的NF-κB信号通路研究。与正常对照组相比,OA软骨组织中TRAF2的mRNA和蛋白表达水平显著上调,而且TRAF2与miRNA-502-5p的表达呈负相关关系。通过软件预测出miR-502-5p与TRAF2 3’-UTR存在靶标关系。与miR-502-5p阴性对照转染组相比,miR-502-5p mimic转染组的pGL3-TRAF2 3’-UTR载体荧光素酶活性显著降低,同时pGL3-TRAF2 3’-UTR mut载体的荧光素酶活性无显著变化。与对照组相比,IL-1p组TRAF2的mRNA和蛋白表达水平都显著升高；与IL-1β组相比,miR-502-5p mimic组TRAF2的mRNA和蛋白表达水平显著下调。与对照组相比,IL-1β组诱导NF-κB通路的激活,使NF-κB蛋白表达水平显著上调,而IκB-α蛋白表达水平显著下调；细胞增殖率下降；细胞凋亡率显著增加；IL-6、IL-8和TNFα的蛋白表达水平显著增加；Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的蛋白表达水平显著减少,而MMP-3、MMP-9和MMP-13等金属蛋白酶的表达显著上升。与IL-1β组相比,PDTC组、miR-502-5p mimic组和si-TRAF2组抑制NF-κB信号通路的激活,使NF-κB表达水平显著下降,而IκB-α表达显著升高；细胞增殖率显著升高；细胞凋亡率显著下降；IL-6、IL-8和TNFα的蛋白表达水平显著降低；Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的蛋白水平显著升高,而MMP-3、MMP-9和MMP-13等蛋白酶的表达显著降低。结论：综上所述,本研究结果表明miR-502-5p在OA软骨组织和IL-1β诱导的软骨细胞中表达显著下调,对IL-1β诱导的软骨细胞损伤有保护作用,包括促进软骨增殖,减少细胞凋亡,降低炎症因子的生成以及促进ECM代谢平衡。p53可以调控miR-502-5p的转录进而影响其表达,而miR-502-5p能够反向抑制p53的表达,表明miR-502-5p与p53形成一个负反馈调控回路。Wnt/β-catenin通过正向调控p53的表达影响miR-502-5p-p53负反馈调节回路。进一步机制分析表明,miR-502-5p靶向调节TRAF2 3’-UTR,降低其表达,进而抑制TRAF2介导的NF-κB信号通路,以此降低IL-1β诱导的软骨细胞损伤,发挥抗凋亡、抗炎和抗基质降解等生物学功能。我们的研究表明miR-502-5p有望成为OA防治的新靶点,为OA的预防和治疗提供新的研究方向。