噻虫嗪酶联免疫吸附测定和免疫层析分析方法的初步建立

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噻虫嗪是一种新烟碱类农药,在农业生产上被广泛使用,农产品中可能会发生噻虫嗪残留,其对消费者的身体健康具有一定的安全隐患。因此加大新烟碱类农药的监控力度是事关国计民生的重大食品安全问题,开发快速检测技术成为新烟碱类农药残留检测的研究趋势。本研究主要分成两个部分:一是制备抗噻虫嗪单克隆抗体,通过实验参数的优化,成功建立了抗噻虫嗪单克隆抗体的酶联免疫分析方法;二是利用胶体金标记技术,通过实验参数的优化,研制了一种胶体金免疫层析方法检测噻虫嗪农药残留,并制作了胶体金免疫层析试纸条。主要结论如下:(1)利用合成的啶虫脒半抗原(H1)、噻虫嗪半抗原(H2)和吡虫啉半抗原(H3),通过活泼酯法制得三种包被抗原H1-OVA、H2-OVA和H3-OVA,基于效价及竞争测定,选用分析灵敏度更好的H2-OVA进行后续实验。通过优化抗原抗体浓度、离子强度和p H值等实验条件,成功建立了检测噻虫嗪残留的间接竞争酶联免疫吸附测定(Bic-ELISA)方法。实验得出最优工作体系为:抗噻虫嗪包被原、抗体稀释1000倍、4000倍时,缓冲液中有5%甲醇,离子强度为0.4 mol/L Na Cl,p H值为9.0的磷酸缓冲液。在最优化条件下,用不同浓度梯度的噻虫嗪标准品检测ELISA方法的性能,绘制标准曲线,得到线性范围为1.0—250.0 ng/m L,IC50值28.6 ng/m L,检出限是0.15 ng/m L,证明该方法具有较好的灵敏度。用七种不同的新烟碱类农药来作交叉反应,最高的交叉反应率为0.28%,其它的几种农药的交叉反应率均低于0.2%,证明该方法具有较好的特异性,可用于噻虫嗪的定性定量检测。(2)基于双抗夹心的检测原理,利用柠檬酸三钠还原法来制备胶体金,以制备的胶体金作为标记物标记噻虫嗪单克隆抗体,将噻虫嗪人工抗原包被在检测线处,羊抗鼠二抗包被在质控线处,成功建立了胶体金免疫层析试纸条检测方法。通过优化实验参数,得到最优的工作体系,即添加20μL 0.1 mol/L的K2CO3溶液的标记p H值、抗体标记量为20μL、采用抗原原液(不稀释)划膜。最后对制备的胶体金试纸条进行了灵敏度进行测试,实验中试纸条的灵敏度为20 ng/m L采用该试纸条检测农产品中残留的噻虫嗪农药灵敏度高、特异性强、稳定性好而且无需特殊仪器设备,适用于农产品中噻虫嗪残留的快速检测。
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