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第一部分:严重型SMA小鼠模型心脏缺陷的病理机制研究目的脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是一种常见的神经肌肉疾病,由于脊髓前角α运动神经元变性导致了近端肌肉自发性萎缩。SMA是由运动神经元生存基因1(SMN1)的缺失或突变引起的。虽然传统的观点认为SMA是一种神经肌肉疾病,但越来越多的证据表明它是一种多系统疾病;在SMA患者和各种小鼠模型中,各种外周组织和细胞类型都受到影响。严重的SMA患者和小鼠模型中心脏均出现了结构性和功能性异常。有趣的是,基于对小鼠模型的研究,心脏结构缺陷先于运动神经元的丧失,并且独立于运动单元的病理和肌肉瘫痪,提示心脏异常在早产儿死亡中的重要作用。现在一般认为SMA小鼠的心脏缺陷是自主神经系统异常所致。然而,到目前为止,还没有关于SMA心脏缺陷在细胞和分子水平的系统而详细的研究。方法利用组织病理染色、免疫荧光染色、TUNEL染色和透射显微成像,观察心肌组织和细胞的病理特征和变化;通过流式细胞仪分析心肌细胞的细胞周期进程的变化;通过Microarray分析变化显著的基因和相关信号通路;通过q PCR和我western blot分析验证变化的关键基因和蛋白,并且寻找关键基因;通过在SMN削减的心肌细胞中过表达关键基因,验证它在心肌细胞中的作用;最后用反义核苷酸ASO10-29治疗SMA小鼠,观察病理表型和关键基因的表达是否恢复。结果严重型SMA小鼠中心脏明显变小且心肌细胞数量减少,有明显的增殖缺陷和细胞凋亡的激活。一组参与细胞周期和细胞凋亡的基因变化紊乱。特别是,Birc5基因,该基因从出生后第0天(P0)开始下调。在SMN削减的原代心肌细胞中,Survivin蛋白过表达促进其细胞周期的运行。反义核苷酸ASO10-29治疗SMA小鼠,显著改善了病理表型,并且Birc5在内的基因表达部分恢复。结论本研究结果显示,SMA小鼠的心脏功能障碍是主要由心肌细胞中广泛存在的基因失调尤其是Birc5基因表达下调所致。这些失调基因影响细胞周期运行和增强细胞凋亡,引起心肌出生后的生长和发育缺陷。第二部分:两种化学修饰MOE和PMO ASO10-29药物对SMA小鼠的疗效比较研究目的反义寡核苷酸(ASO),是一段人工合成的核苷酸或核苷酸类似物,通过Waston-Crick碱基配对与互补RNA序列结合,达到沉默基因或调控RNA剪接的目的。近年来数个ASO药物的上市宣告ASO可以作为一种新型化学类药物在人类与疾病的斗争中大有可为。现在ASO的新药研发已获得医学界的广泛重视,特别是在心血管疾病、癌症和神经退行性疾病等领域。未经修饰的ASO容易被内源性核酸酶识别、切割,在体内迅速降解。为了增加ASO的耐受性、与RNA结合的亲和性以及延长在组织中的半衰期,在ASO的糖基及核苷酸之间连接的磷酸键进行各种不同的化学修饰从而赋予ASO以药的特征。第一代ASO化学修饰的代表是连接核苷酸之间磷酸的P=O以硫替代一个氧形成含P=S的硫代磷酸键。而二代化学修饰中应用最为广泛的是糖基2’位的MOE(methoxyethyl)和PMO(phosphorodiamidate morpholino oligomer)。2016年9月和12月美国FDA批准上市用于治疗杜氏肌营养不良症(DMD)的Eteplirsen和治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)的Nusinersen分别为PMO和含P=S的MOE修饰。Nusinersen通过纠正SMN2外显子7的剪接增加SMN的表达水平从而达到治疗的目的。然而,迄今为止,还没有完整深入的关于MOE和PMO两种修饰效果的比较研究,本课题将为未来ASO药物的研发和应用提供重要依据。方法本课题采用台湾严重型SMA小鼠模型,ASO药物为Nusinersen的加长版ASO10-29,药效优于Nusinersen。经脑室和皮下注射到刚出生的SMA小鼠,通过比较小鼠各组织SMN2剪接变化和表型的改善状况,确定MOE和PMO对SMA疗效的优劣。课题通过RT-PCR和western blot分析六种组织(脑、脊髓、肝脏、心脏、肾脏和肌肉)中SMN2外显子7的列入量和SMN蛋白水平的改变。表型观察包括寿命和体重的变化,并通过免疫荧光染色观察计数α运动神经元的数量和运动神经元中gem的数量,通过握力和旋转测试来评估小鼠治疗后的运动能力;通过NMJ染色观察分析NMJ的复杂性和神经支配能力。结果脑室注射MOE和PMO ASO10-29后都适度延长了严重型SMA小鼠寿命,但是两者之间没有差异。系统性给药后,均显著延长了小鼠寿命并且具有剂量效应,其中MOE修饰的ASO10-29可以维持更长的寿命,效果更加明显。MOE和PMO ASO10-29均可显著增加6种组织中全长SMN2 m RNA和SMN蛋白水平,其中PMO更容易进入CNS中,但是MOE在组织中发挥作用的时间更长。结论系统性给药MOE和PMO ASO10-29治疗SMA小鼠效果远好于脑室注射的方式。PMO ASO 10-29更容易进入CNS,但是由于MOE ASO 10-29在外周组织中的持续作用,较长半衰期,使得MOE更好的延长小鼠寿命并改善表型。