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背景:胶质瘤是恶性程度最高的脑肿瘤,手术难以全切,对放化疗易产生耐受。自噬异常是胶质瘤对放化疗产生耐受的原因之一,但其调控的机制不明。研究表明,T-淋巴细胞来源的蛋白激酶(TOPK)在胶质瘤干细胞中特异性表达,与胶质瘤放化疗耐受、复发密不可分,但作用机制尚不清楚。目的:1、明确TOPK与自噬的关系。2、阐明TOPK调节自噬的分子机制。3、探索TOPK调控自噬后在胶质瘤对替莫唑胺(TMZ)耐药中的作用。方法:1、收集胶质瘤临床标本和人源性胶质瘤细胞株,Western Blot方法检测自噬活性标志分子(LC3-II和P62)。2、采用沉默或过表达方法降低或增加TOPK表达或采用TOPK特异性抑制剂抑制其活性,Western Blot方法检测自噬活性标志分子(LC3-II和P62)水平;透射电镜实验和荧光实验观察自噬体。3、采用生物信息学技术预测TOPK潜在底物:ULK1是其中之一。4、构建ULK1三个功能域的真核表达质粒,采用Pull down方法确认TOPK与ULK1的相互作用及作用部位。5、采用NetPhos 2.0预测ULK1潜在的磷酸化位点并体外合成相对应肽段。6、体外激酶实验和质谱确认TOPK直接磷酸化ULK1,并鉴定具体磷酸化位点。7、在TOPK沉默、活性抑制和过表达细胞中,Western Blot方法检测ULK1和其内源性底物Beclin-1及Atg13的磷酸化水平。8、采用定点突变方法构建ULK1被TOPK磷酸化修饰的位点失活突变型真核表达质粒,转染293T细胞,Western Blot方法检测ULK1(反应其稳定性)、磷酸化Beclin-1和磷酸化Atg13(反应ULK1活性)、LC3-II(反应自噬活性)。9、在293T细胞中共转染TOPK、泛素及野生型或突变型ULK1质粒,免疫共沉淀方法检测ULK1泛素化水平。10、TMZ和TOPK抑制剂联用处理TOPK高表达的胶质瘤细胞或者用TMZ处理TOPK沉默细胞株,Western Blot方法检测凋亡分子:Caspase-3;MTT法和软琼脂克隆实验检测细胞增殖和锚定非依赖生长能力。11、在TOPK高表达的细胞中建立稳定表达野生型或突变型ULK1细胞株,并用TMZ处理细胞,Western Blot方法检测凋亡分子:Caspase-3;MTT法和软琼脂克隆实验检测细胞增殖和锚定非依赖生长能力。结果:1、高级别胶质瘤高表达TOPK和P62,低表达LC3-II。2、高表达TOPK的胶质瘤细胞株高表达P62,低表达LC3-II。3、抑制TOPK活性和沉默TOPK表达,促进LC3-II表达,抑制P62表达;而过表达TOPK,抑制LC3-II表达,促进P62表达。4、沉默TOPK表达,增加自噬体数量。5、ULK1是TOPK底物,且TOPK与ULK1的SPR结构域相互作用。6、在体外,TOPK磷酸化ULK1的Ser469、Ser495和Ser533三个位点。7、质谱确认ULK1的S469磷酸化修饰在细胞内存在。8、抑制TOPK,增强ULK1活性和稳定性;而过表达TOPK,减弱ULK1活性和稳定性。9、ULK1的Ser469、Ser495和Ser533三个位点失活突变后,ULK1的活性增加,半衰期延长,并且导致细胞的LC3-II表达上调。10、TOPK抑制剂和TMZ联用,促进高表达TOPK胶质瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖和克隆形成能力;用TMZ处理TOPK沉默细胞株,获得相同结果。11、稳定表达Ser469、Ser495和Ser533三位点失活突变ULK1的细胞株,用TMZ处理,细胞凋亡增加,细胞增殖及锚定非依赖生长能力降低。结论:1、TOPK抑制细胞自噬。2、TOPK与ULK1的SPR结构域相互作用,并在Ser469,Ser495和Ser533三个位点磷酸化ULK1,抑制ULK1活性及降低其稳定性,进而抑制自噬起始。3、TOPK磷酸化ULK1抑制细胞自噬活性,促进胶质瘤对TMZ耐药。