目的建立血液中乙醇含量的自动顶空-气相色谱-质谱检测方法(HS-GC-MS);考察静脉血和心脏血中乙醇在不同保存条件下的稳定性。通过研究静脉采血消毒剂及消毒操作过程对血液中乙醇含量的影响,探讨采血对样本的可能污染来源及对血液中乙醇含量的影响。论文通过研究血液中乙醇含量的测定过程,分析采用HS-GC-MS法测定血液中乙醇含量的不确定度来源,给出采用该方法测定血液中乙醇含量的检测结果的合成标准不确定度和扩展不确定度。本文建立了HS-GC-MS法测定血液中乙醇含量的质控图,为实验室开展日常酒驾检测结果的质量控制提供保障。方法(1)血液中乙醇含量的HS-GC-MS法测定：①样品处理方法：准确移取0.200mL标准溶液或者血液样品于20mL顶空瓶中,加入0.100mg/mL的叔丁醇内标溶液0.800mL,立即用硅胶橡皮盖密封。②自动顶空条件：对自动顶空的平衡时间和温度进行探讨和选择,确定炉温：60℃,平衡时间：20min。传输线温度100℃,进样传输线温度90℃,进样间隔3min,样本瓶加压时间、定量环充满时间和进样时间均为10s。③气相色谱条件：选用Rxi-5MS, 30mx0.25mmx0.25μm色谱柱,载气为氦气,流速为1mL/min;进样口温度为150℃,分流进样；柱温：60℃,保持1.8min。④质谱条件：离子源温度和传输线温度均为：250℃；电离方式为电子轰击,电离能70eV。溶剂切除时间1.2min;选择离子监测模式(SIM)；间隔：O.1s。确定乙醇和叔丁醇的监测离子分别为m/z=29、31、45、46和m/z=41、43、57、59。(2)血液中乙醇稳定性研究：①实验对象：从送检的乙醇检测样本中,选出普通塑料管盛装的心脏血液样本20例,正规采血管密封的静脉血液样本10例；用已建立的方法检测其初始血液中乙醇的含量。②静脉血液样本实验过程：将静脉血置于室温(25℃)下,并于2h,24h,48h,72h分别检测其血液中乙醇浓度；③心脏血液样本实验过程：将20例样本分别取3份密封于EP管中,每份0.75mL,第1份冷冻保存(-18℃),第2份冷藏保存(4℃),第3份室温保存(25℃),并于2h,6h,12h,24h,168h(7天),336h(14天)和720h(30天)分别检测其乙醇浓度。实验中每个样本均做两次平行测定,每批样本测定时随行制作一条标准曲线,每10个样本后加一个标准质量控制样(浓度为0.800mg/mL)。采用SPSS20.0统计软件进行重复测量方差分析,先进行Mauchly的球形度检验,若p<0.001,则采用Huynh-Feldt调整后的F值和p值。(3)采血消毒对乙醇污染的分析：由于血液中乙醇的污染可能来源于采血时所用的消毒液,因此本实验采用Ⅱ型安尔碘(含65～75%乙醇)作为静脉采血前皮肤消毒剂,以醋酸洗必泰(不含乙醇)作为对照进行研究。①实验对象以及条件：30名志愿者随机分为3组,每组男、女各5名。年龄在20～55岁之间,身体健康并对乙醇无过敏症状。所有志愿者在被采血前48小时内均未饮酒。②实验过程：第1组志愿者右肘用Ⅱ型安尔碘清洁皮肤三次,未等消毒剂干燥立刻进行静脉穿刺采血；第2组右肘进行同样的消毒后,待消毒剂干燥30s后采血。第1、2组左肘均用醋酸洗必泰进行相同的消毒和采血。第3组志愿者的左肘使用Ⅱ型安尔碘清洁皮肤三次,立刻进行静脉穿刺采血；右肘进行同样的消毒,干燥30s后采血。实验中第1、2组的受试对象全部采用干燥不含乙醇的棉签按压伤口后拔针,第3组则采用安尔碘完全浸润的棉签按压伤口后拔针。实验中采用一次性针头穿刺采血2mL,直接收集于K2EDTA干燥真空抗凝采血管,混匀,用所建立的方法检测。(4)血液中乙醇含量不确定度评定：依据不确定度评定的指导性文件,从分析测量过程入手,详细研究测量方法、测量系统和测量程序,根据检测操作流程和结果的计算公式构建乙醇含量测定不确定度的因果关系结构图,画出测量方法的测量流程图,并分别计算相应的不确定度。①制样及分析：取一支阳性血液样本,移取0.20mL乙醇标准液或血样于20mL顶空瓶中,加入0.100mg/mL叔丁醇内标溶液0.80mL,封瓶,用已建立的方法进行分析,测得其乙醇浓度。②A类不确定度的评定方法：在同一条件下对浓度为0.80mg/mL的质量控制样品重复测量40次,用统计分析方法获得40份检测结果平均值x、残差平方和v2,实验标准偏差S(Xk)以及A类不确定度；③B类不确定度的评定方法：根据有关的信息或经验,判断被测量的可能值区间(；-a,x+a),依照概率分布和要求的概率P确定κ。分析得到本实验中B类不确定度来源有：乙醇标准溶液和叔丁醇引入的相对不确定度,移液器和GC/MS引入的相对标准不确定度,标准曲线引入的相对不确定度以及峰面积和实验室环境引入的不确定度。则B类评定的标准不确定度u(x)可由公式u(x)=a/k计算；④合成标准不确定度的评定方法：由各输入量的标准测量不确定度获得的输出量的标准测量不确定度。由于乙醇浓度测定过程中各个输入量之间均不相关,因此合成标准不确定度的计算公式为：⑤扩展不确定度的评定方法：扩展不确定度U由合成标准不确定度uc乘包含因子k得到,按公式：U=kuc计算。(5)质量控制图的绘制：记录实验中每次随行测量的浓度为0.80mg/mL的乙醇标准质量控制样品100次,计算平均值(x)以及标准差(s),求得上、下控制线——UCL.LCL(x±3s),上、下警告线-UWL、LWL(x±2s)以及上、下辅助线—UAL、LAL (x±s)值。平均值(x)用来界定分布的中心,标准差(s)表明数据的展开情况。以测定顺序为横坐标x轴；测定结果为纵坐标y轴；预期值(即平均值)为中心线；±3s为控制限,表示测定结果的可接受范围；±2s为警告限,表示测定结果目标值区域；±s为检查测定结果质量的辅助指标所在区间,绘制出本实验的质量控制图。计算出上、下辅助线之间的点数占总点数的百分比,检验该质控图是否适用。最后用同条件测定的20次质控样品对质量分析进行评定,看质控样是否落在上、下警告限之内,判断乙醇测定结果是否可信。结果(1)建立了自动顶空-气相色谱-质谱检测血液中乙醇含量的方法,通过优化方法后,选定顶空的平衡温度和平衡时间分别是60℃和20min,乙醇和叔丁醇的定量离子分别45和59,乙醇和叔丁醇的出峰时间分别为1.47min和1.56min。以乙醇浓度(x)对乙醇和叔丁醇定量离子的峰面积比值(y)作标准曲线,浓度范围在0.01～10.00mg/mL的线性回归方程为y=0.28865x-0.00304,相关系数r为0.9998。检出限(3S/N)为0.0006 mg/mL,定量检测限(10S/N)为0.002 mg/mL。乙醇的回收率为99%-112%,方法的相对标准偏差RSD(n=6)小于5%。(2)血液中乙醇稳定性结果：①静脉血液在室温(25℃)下放置24、48和72h,在48h之前乙醇浓度没有明显变化,表明样品在本实验室的室温条件下至少两天内(48h)是稳定的。②在冷冻(-18℃)条件下,心脏血中乙醇在30天内稳定(p>0.05)；冷藏(4℃)保存时7天内心脏血中的乙醇是稳定的(p>0.05),在第14天以后至30天乙醇浓度略有减少(p<0.001)。心脏血中的乙醇在室温下(25℃)2h内是稳定的(p=0.717),在6h至24h,心脏血中乙醇浓度出现明显增加(p<0.001),在24h以后乙醇浓度下降。(3)采血消毒对乙醇污染：使用干燥棉签按压方式拔针时,无论消毒剂是否含有乙醇、皮肤上的消毒剂是否干燥,血液样本均未检测出乙醇。使用经安尔碘溶液(含乙醇)浸润的棉签按压伤口进行拔针时,10个样本有4个以上被乙醇污染,检出乙醇的浓度为0.0030-0.0270mg/mL。(4)血液中乙醇含量不确定度评定：本实验室采用HS-GC-MS法对血液中乙醇含量的测定,血液中乙醇含量的不确定度主要由样品检测、乙醇标准溶液和标准曲线引入,而检测仪器、内标带、样品等带来的不确定度很小,可忽略不计。血液中的乙醇浓度平均值为0.738mg/mL时,根据本文不确定度的计算方法其合成标准不确定度为0.040mg/mL,扩展不确定度为0.080mg/mL(κ=2)。(5)质量控制图的绘制：浓度为0.80mg/mL的标准质量控制样品的100次质控结果的X=0.804 mg/mL, s= 0.045,UCL=0.938mg/mL、CL=0.669 mg/mL; UWL=0.894 mg/mL、LWL=0.714 mg/mL 和 UAL=0.849 mg/mL、LAL=0.759 mg/mL。100次质控结果分布在上、下辅助线之间的点数占总点数的72%。用所得质控图检验10次质量标准控制样品,测定值均落在上、下警告限之内。,分析结果质量正常,试样测定结果可靠。结论：(1)本文所建立的自动顶空-气相色谱-质谱检测方法充分利用了色谱的分离和质谱的定性功能,可对样品中乙醇的含量进行快速准确的定量定性分析。能够满足司法和临床血液中乙醇含量分析；(2)在对影响血液中乙醇含量测定的影响因素进行探讨中发现,静脉血液样本的存放在室温下不超过2天,心脏血在室温下放置不超过2小时,这样才可以保证结果的真实有效；(3)在国内的临床采血规范中,只要求是经过消毒的棉签,所以使用干燥(不含乙醇)或者经由消毒剂浸润(含乙醇)的棉签按压伤口都是合乎临床规范的。研究表明采血时皮肤消毒对血液中乙醇含量没有影响；(4)全文通过对临界值不确定度进行分析和制作质量控制图,很好的对检测结果进行了质量控制,为准确可靠的分析测定血液中乙醇含量提供依据。