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磷脂酶D(phospholipase D, PLD)主要水解磷脂如磷脂酰胆碱(phosphocholine, PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphoethanolamine, PE)等产生磷脂酸(phosphatidic acid, PA)和游离的头部基团。它们与磷脂酶C (phospholipase C, PLC)、磷脂酶A (phospholipase A, PLA)共同组成一个庞大的磷脂酶家族。模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组有12个PLD基因,分为PLDa(3)、PLDP(2)、PLDy(3)、PLDδ、 PLDε和PLDζ(2)六类。AtPLDα1和AtPLDδ是含量最多的蛋白。PA是植物体内一种重要的信号分子,通过与靶蛋白的互作,广泛参与多种生理生化过程,如气孔运动、抗冷和脱水等。微管(microtubule)与微丝(actin)共同组成植物细胞的骨架系统。微管骨架调控细胞形状的改变、细胞分裂、细胞内物质运输和信号转导等重要过程。在植物体内,由具有类似于动物的中心体功能的y-tubulin驱动四种微管排列的形成,即间期排列(interphase cortical array)、早前期带(preprophase band, PPB)、有丝分裂纺锤体(mitotic spindle)和成膜体(phragmoplast)。在这些结构形成过程中微管结合蛋白(microtubule-associated proteins, MAPs)起着重要的作用。本实验室前期工作已经证明pld11α1对盐胁迫敏感,且初步确定了PLDα1/PA是通过MAP65-1调控拟南芥盐响应过程的。本文进一步研究PLDα1/PA与MAP65-1结合及其互作机制。首先用10μM oryzalin(微管解聚剂)处理WT(野生型)、pldα1、map65-1-1和map65-1-2,然后通过免疫荧光标记微管的方法观察到pldα1、map65-1-1和map65-1-2对oryzalin比WT敏感,微管解聚更严重。200mM NaCl处理下,map65-1-1和map65-1-2存活率显著低于WT; pldal和pldalmap65-1-1存活率也显著低于WT,微管解聚更严重。外源施加20μM16:0-18:2PA (palmitoyl-linoleoyk PA)则能提高pldal的耐盐能力,使其存活率上升,与WT无差异,微管数目也与WT相接近,而PA不能缓解map65-1-1和pldalmap65-1-1的盐敏感的表型,它们的微管数目显著低于PA和NaCl共处理下的WT和pldal的微管数目。这些结果从遗传学角度证明在盐胁迫反应中,PLDal/PA信号可能位于MAP65-1的上游。我们进一步研究PA结合MAP65-1的位点。通过定点突变和脂-蛋白结合技术,证明MAP65-1的53-55位氨基酸残基KRK、61-63位的KSR和428-429位的SK是PA结合位点。随后通过脂微囊体免疫共沉淀、ELISA和原生质体过表达进一步证明这8个氨基酸是PA结合位点。然后将MAP65-6(与PA结合弱)与MAP65-1同源区域的氨基酸突变为KRK. KSR和SK,我们发现,突变的MAP65-6结合PA显著增强,进一步说明此8个氨基酸在PA结合中的重要性。浊度法发现,虽然突变的MAP65-6结合PA增强了,但它对促进微管聚合没有影响,即使加入外源的PA,也不能促进微管聚合。这说明PA-MAP65-1互作在调控微管形态中的特异性。我们接着研究PA与MAP65-1结合是否有利于耐盐性。25mM NaCl处理原生质体后,过表达含有这8个氨基酸突变的MAP65-1(mutant)的原生质体细胞死亡率显著高于过表达MAP65-1(WT)的原生质体。与微管共沉淀、在原生质体过表达和对体外微管成束等实验结果表明,这8个氨基酸突变导致MAP65-1不能结合和成束微管。最后,我们通过瞬时侵染拟南芥的方法观察MAP65-1与微管的共定位。对照下,无论在WT还是pldα1中,MAP65-1与微管共定位,微管数基本相同。50mM NaCl处理24h后,WT和pldα1的微管均发生解聚,但pldal的微管解聚地更严重,几乎全部解聚,成点状结构,此时MAP65-1与解聚的微管共定位。外源施加：20μM16:0-18:2PA则使pldα1的微管恢复到WT的状态,MAP65-1重新与完整的微管结合。这些结果提示,盐诱导微管解聚以及MAP65-1与微管分离,作为耐盐机制的一部分,盐胁迫下,PLDoα1水解磷脂产生PA,后者结合MAP65-1并促进微管稳定,提高细胞耐盐能力。