【摘 要】
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氨基甲酸乙酯（EC）是一种存在于黄酒中的潜在致癌物,脲酶因其可降解EC的前体物质尿素而备受关注。为提高黄酒的食品安全,本研究在枯草芽孢杆菌中实现了基因挖掘所得的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）IT-45中脲酶（Ba-urease）的表达与应用。通过对包含目的脲酶基因的重组枯草芽孢杆菌进行表达调控和发酵优化,提高了重组菌的脲酶活性,并验证了其有效降解尿素的功能。
【基金项目】
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国家重点研发计划项目子课题“传统黄酒安全生产的酶制剂筛选方法及安全评价技术”,项目编号2018YFC1604102；
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氨基甲酸乙酯（EC）是一种存在于黄酒中的潜在致癌物,脲酶因其可降解EC的前体物质尿素而备受关注。为提高黄酒的食品安全,本研究在枯草芽孢杆菌中实现了基因挖掘所得的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）IT-45中脲酶（Ba-urease）的表达与应用。通过对包含目的脲酶基因的重组枯草芽孢杆菌进行表达调控和发酵优化,提高了重组菌的脲酶活性,并验证了其有效降解尿素的功能。本研究为黄酒中尿素的降解提供了一种有效的方案,在传统发酵食品工业中具有一定的应用前景。（1）通过前期的脲酶基因序列、结构分析,挖掘获得来源于B.amyloliquefaciens IT-45的只包含三个结构亚基Ure A、Ure B、Ure C的脲酶基因簇Ba-urease。将该脲酶基因簇在枯草系统Bacillus subtilis WB168、B.subtilis WB600、B.subtilis WB800中分别重组表达,比较生长趋势与酶活,发现重组菌株B.subtilis WB600/p P43NMK-Ure获得较高的脲酶活力,为6.85 U·m L-1。因此,选定B.subtilis WB600/p P43NMK-Ure进行后续研究。（2）采用枯草密码子优化、核糖体结合位点优化重新组装Ba-urease的策略,使Ba-urease的酶活力从6.85 U·m L-1提升至9.01 U·m L-1;通过调整基因ure C至ure A、ure B前,强化了Ure C的表达,重组菌株B.subtilis WB600/p P43NMK-Ure-2的脲酶活力进一步提升至10.15 U·m L-1,相对于原始脲酶活力提高了48%。通过更换高强度的组成型启动子重构脲酶表达菌株,但因质粒的不稳定性而未成功提高脲酶活性,依旧选定P43启动子作为表达启动子。对重组脲酶表达菌株B.subtilis WB600/p P43NMK-Ure-2在500 m L摇瓶发酵的基础上进行发酵条件优化,最终确定TB培养基、3%接种体积分数、28℃表达温度、4 mmol·L-1 Ni2+添加量为最佳发酵条件。在此条件下,重组脲酶Ba-urease的活力达到12.5 U·m L-1,相对于原始脲酶活力提高了82%。（3）探究了重组脲酶的酶学性质,可得:最适反应温度为37℃,且在30℃-37℃范围内可以保持30%以上的酶活力;最适反应p H范围为6.5-7.0,为中性脲酶。此外,该重组脲酶在30℃-50℃及p H 6.0-7.0范围内具有相对较好的稳定性,亦可耐受一定低浓度（0%-15%）的乙醇。这为日后开发有效降解酒精饮料中尿素的技术奠定了基础与研究方向。通过高效液相色谱检测到,重组脲酶可以直接有效地降解尿素溶液中的尿素,降解率约为36%-68%;运用于模拟酒样时,尿素降解率为20%-35%;而在黄酒体系中降解率降低为7%,此时重组脲酶菌株的降解率也只能达到11%。基于该重组脲酶在混合体系中应用的局限性,本研究同时采用了包埋法、交联法的固定化方式处理重组脲酶菌株,随后应用在黄酒酒样中,尿素降解率分别约为30%、20%。重组脲酶安全有效、操作方便,反应p H及其稳定性仍需进一步提高。
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