酒精性肝病(alcoholic liver diseases, ALD),包括酒精性脂肪肝,酒精性肝炎,酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化,是最常见的肝脏疾病,占肝硬化死亡原因的40%,全部肝脏疾病死亡原因的28%。酒精性肝病的发病机制复杂,主要包括酒精及代谢产物的直接肝脏毒性,酒精诱导的活性氧的产生及代谢(氧化应激),组织缺氧,内质网应激,铁超载,细胞凋亡及免疫机制等。然而,酒精性肝病的具体发病机制仍然不详。钙离子(calcium ion, Ca2+)作为常见的第二信使,参与了许多的细胞功能,包括能量代谢,细胞死亡等。钙池调控的钙离子通道(store-operated calcium channels, SOCs)是非兴奋细胞钙离子内流的主要通道,它是由基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1, STIM1)和钙释放激活的钙通道蛋白1 (calcium release-activated calcium channel protein 1, CRAR,也叫做Orai1)组成。钙池调控的钙离子内流(store operated calcium entry, SOCE)与钙稳态之间关系密切,可通过感受内质网的钙离子水平,介导细胞外钙离子内流以补充钙库,并增加胞浆中钙离子浓度。前期研究证明乙醇慢性刺激HepG2细胞可通过上调SOCE相关蛋白分子的表达显著增加细胞外钙离子内流。然而,尽管HepG2细胞仍然保留着很多在人类干细胞中表达的Ⅰ,Ⅱ阶段的酶而被广泛应用于体外肝脏毒性的研究,但HepG2细胞仍不能完全代表原代肝细胞。而且,SOCE在乙醇诱导的肝细胞损伤中的作用机制仍知之甚少。因此,本实验旨在研究SOCE在乙醇诱导的肝细胞损伤中的作用机制,并且通过体内外阻断SOCE后观察其在缓解酒精性肝病中的效果,为深入探讨酒精性肝病发病机制及寻找治疗的新靶点提供实验基础。第一部分：钙离子在乙醇导致的肝细胞损伤中的作用目的：通过观察乙醇刺激之后肝细胞形态的变化,检测肝细胞损伤的情况及胞浆中游离钙离子浓度(cytoplasmic free Ca2+ concentration, [Ca2+]cyt),并给予细胞内外钙离子螯合剂后,检测胞浆中钙离子浓度的变化,肝细胞的损伤情况,分析钙离子在乙醇诱导的肝细胞损伤中的作用。方法：1.细胞培养：正常大鼠肝细胞BRL细胞株,给予DMEM (dulbecco’s modified eagle’s medium)(高糖)和10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)进行常规培养。当BRL细胞达到80%—90%融合时传代,选择第4-6代进行下一步实验。2.细胞处理分组：BRL细胞常规培养后,种入六孔板中,细胞贴壁后,分别给予不同刺激,分为0、25mM、50mM、100mM、200mM、400mM不同浓度的乙醇刺激(24小时)组。正常对照组,乙醇刺激组,乙醇加乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)刺激组及乙醇加BAPTA-AM刺激组。3.肝细胞形态的观察：0、50mM、100mM、200mM不同浓度的乙醇刺激细胞24小时后,在显微镜下观察BRL大鼠肝细胞形态的变化。4.胞浆中钙离子浓度的检测：采用Fluo-3/AM对细胞中的钙离子进行标记,通过流式细胞仪检测肝细胞中游离钙离子的浓度。5.肝细胞损伤情况的评估：采用MTT法检测各组中肝脏细胞的存活率,同时取各组细胞上清,通过全自动生化分析仪进行生化学检测。结果：1.乙醇对BRL细胞形态的影响：与正常对照组肝细胞相比,50mM、100mM、200mM的乙醇刺激24小时后,大部分的肝细胞明显肿胀,并且细胞呈多角形,部分可见凋亡小体。2.乙醇对BRL细胞损伤的影响：0、25mmM、50mM、100mM、200mM、400mM的乙醇浓度依赖性的降低BRL细胞的存活率,同时浓度依赖性的升高细胞培养基上清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)的水平,且AST升高较ALT明显。其中l00mM的乙醇刺激后BRL细胞的存活率为57.58%+2.08%,所以选取100mM(半数致死量)的乙醇作为下一步的刺激浓度。3.乙醇对胞浆中游离钙离子浓度的影响：0、25mM、50mM、100mM、200mM、400mM的乙醇浓度依赖性的升高BRL大鼠肝细胞中胞浆游离钙离子的浓度。4.钙离子螯合剂对于胞浆中游离钙离子浓度的影响：细胞外钙离子螯合剂EDTA及细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM均可降低胞浆中因乙醇升高的钙离子浓度,二者之间无统计学差别。5.钙离子螯合剂对于肝细胞损伤的影响：细胞外钙离子螯合剂EDTA及细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM均可升高因乙醇降低的细胞存活率,降低因乙醇升高的ALT、AST的水平,二者之间无显著的统计学差别。结论：1.乙醇可浓度依赖性的降低BRL细胞的存活率,升高培养基上清中转氨酶的水平,并增加了胞浆中游离钙离子的浓度,表明钙离子可能在乙醇诱导的肝细胞损伤中发挥作用。2.细胞内外的钙离子螯合剂均可降低胞浆中游离钙离子的浓度,减轻肝细胞的损伤,进一步证明钙离子可能在乙醇诱导的肝细胞损伤中发挥作用。第二部分：SOCE在乙醇诱导的BRL细胞损伤中的作用机制的研究目的：通过检测乙醇刺激后SOCE相关蛋白分子STIM1、Orai1的基因及蛋白的表达,并且给予SOCE药物阻断剂和shRNA干扰技术抑制SOCE后,分别检测胞浆中游离钙离子浓度的变化,肝细胞损伤情况,并通过流式细胞仪检测体外各组细胞的凋亡率,细胞周期及线粒体膜势能的变化,检测肝细胞胞浆中及线粒体中细胞色素C(Cytochrome C, CytC)的变化,通过western blot检测各凋亡蛋白的变化,以研究SOCE在乙醇诱导的BRL细胞损伤中的作用机制。方法：1.细胞转染及转染效率的检测：设计并合成针对SOCE相关蛋白分子STIM1、 Orai1的shRNA的序列。利用转染试剂Lipo2000将合成的针对STIM1和Orai1的shRNA分别转染到BRL细胞中,4-6小时后换液,24小时后提取蛋白,通过western blot验证转染的效率。2.细胞处理分组：磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)组、100mM乙醇刺激24小时组、48小时组、72小时组；PBS组、100mM乙醇、乙醇+科罗索酸组、乙醇+La3+、乙醇+2-APB、乙醇+GSK-7975A、乙醇+R02959、乙醇+shRNA STIM1干扰组、乙醇+shRNA Orai1、乙醇+shRNA STIM1+ shRNA Orai1干扰组。3.检测SOCE相关蛋白分子STIM1、Orai1的表达量：以上刺激结束后,分别提取各组的总RNA及总蛋白,通过qPCR及western blot分别检测乙醇刺激后STIM1、Orai1的基因及蛋白的表达情况。4.检测胞浆中游离钙离子浓度的变化：通过流式细胞仪检测加入SOCE阻断剂及SOCE相关蛋白分子shRNA干扰后肝细胞中钙离子浓度的变化。5.检测肝细胞的损伤情况：通过MTT法,及全自动生化分析仪分别检测加入SOCE阻断剂及SOCE相关蛋白分子shRNA干扰后肝细胞的存活率及转氨酶的变化。6.检测体外各组细胞的凋亡率、细胞周期、线粒体膜势能(mitochondrial membrane potential, MMP):收集体外实验各组的细胞,采用Annexin-V/PI染色、碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色及罗丹明(Rhodamine123,Rh123),通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率、细胞周期及线粒体膜势能的变化。7.检测各组细胞的胞浆及线粒体中的细胞色素C的含量及各凋亡蛋白的表达情况：分别收集肝细胞的胞浆及线粒体部分,检测胞浆及线粒体中细胞色素C的含量,并通过western blot检测SOCE相关蛋白分子及各凋亡蛋白的表达量。结果：1.针对STIM1、Orai1有效的shRNA的筛选：设计合成针对STIM1、Orai1的shRNA,通过western blot检测发现shRNA可明显的抑制STIM1、Orai1的蛋白表达量。2.乙醇对SOCE相关蛋白分子STIM1、Orai1表达的影响：与PBS组相比,100mM乙醇明显增加了STIM1、Orai1的基因及蛋白的表达量,并且影响持续达72小时。3. SOCE阻断剂及shRNA干扰后对胞浆中游离钙离子浓度的影响：科罗索酸、La3+、2-APB、GSK-7975A、RO2959、shRNA STIM1、shRNA Orai1、shRNA STIM1+shRNA Orai1均可明显降低乙醇诱导的胞浆中升高的钙离子浓度,且各阻断剂之间无显著的统计学上的差别。4. SOCE阻断剂及shRNA干扰后对肝细胞损伤的影响：科罗索酸、La3+、2-APB、 GSK-7975A、RO2959、shRNA STIM1、shRNA Orai1、shRNA STIM1+shRNA Orai1均可明显升高乙醇降低的细胞存活率,降低乙醇升高的转氨酶,且各个阻断剂之间无显著的统计学上的差别。5.各组刺激对细胞凋亡率、细胞周期及线粒体膜势能的影响：与正常对照组相比,100mM乙醇刺激可明显升高肝细胞的凋亡率；增加S期的细胞数量,降低G2/M期的细胞数量,表明S期阻滞增加；降低了Rh123的荧光浓度,即降低了线粒体膜势能；与乙醇刺激组相比,各阻断剂及shRNA干扰可降低肝细胞的凋亡率,减轻S期阻滞,升高线粒体膜势能。6.各组刺激对细胞色素C的影响：与乙醇刺激组相比,阻断SOCE后胞浆中细胞色素C含量相对减少,而线粒体中细胞色素C的含量相对增加,说明阻断SOCE可明显减少线粒体中的细胞色素C释放入胞浆。7.体外阻断SOCE对于STIM1、Orai1及各凋亡蛋白表达的影响：与乙醇刺激组相比,阻断SOCE可降低SOCE相关蛋白分子STIM1、Orai1的蛋白量的表达,同时降低了乙醇刺激增加的Bax/Bcl-2的比值,减少了caspase3的激活。结论：1.乙醇可明显的增高SOCE相关蛋白分子STIM1、Orai1的基因及蛋白表达,且影响可持续72小时,说明SOCE可能参与乙醇诱导的BRL细胞的损伤。2.与乙醇刺激组相比,SOCE阻断剂及shRNA干扰后,可明显的降低胞浆中游离钙离子的浓度,升高细胞存活率,并降低转氨酶的水平,且各阻断剂之间没有显著地统计学上的差别,进一步说明了SOCE可能在乙醇导致的BRL细胞的损伤中发挥作用。3.乙醇刺激可明显增加BRL细胞的凋亡率及S期阻滞,而阻断SOCE可明显减轻BRL细胞的凋亡及S期阻滞,表明阻断SOCE可能通过抑制凋亡减轻乙醇导致的BRL细胞的损伤。4.乙醇刺激可降低BRL细胞的线粒体膜势能,促进细胞色素C从线粒体进入胞浆,升高Bax/Bcl-2的比值,激活caspase3。而阻断SOCE可明显减轻上述过程,进一步说明在酒精性肝病中SOCE可能通过诱导凋亡而导致BRL细胞的损伤。第三部分：SOCE在酒精诱导的大鼠肝脏损伤中的作用目的：通过观察酒精灌胃组大鼠SOCE相关蛋白分子STIM1、Orai1的表达及定位情况,并且给予SOCE阻断剂科罗索酸后,观察大鼠肝脏组织损伤情况,检测转氨酶的变化。同时检测体内肝脏组织胞浆中及线粒体中细胞色素C的变化,通过western blot检测各凋亡蛋白的变化,进一步分析SOCE在酒精导致的大鼠肝脏组织损伤中的作用机制。方法：1.体内试验的分组：将40只成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠分为正常对照组,酒精性肝病模型组,酒精+科罗索酸治疗1组(治疗4周),酒精+科罗索酸治疗2组(治疗8周)。酒精性肝病模型组：将60%的北京红星二锅头用水稀释,用4.5、6.5、9g/Kg/天分别灌胃1-4周、5-8周、9-12周,一天剂量分两次灌胃。正常组给予等量的生理盐水灌胃,一天两次。科罗索酸1组：开始于第八周,酒精灌胃之前10分钟给予4mL 20%的科罗索酸灌胃,共治疗4周。科罗索酸2组：灌胃方法同1组,开始于第四周,共治疗8周。大鼠在实验前后称重,留取血样,并将肝脏组织放入液氮或甲醛中备用。2.检测酒精灌胃后SOCE相关蛋白分子的表达情况及定位：通过western blot和免疫组化检测酒精灌胃后STIM1、Orai1蛋白的表达及定位情况。3.检测各组肝脏组织的损伤情况：通过HE染色观察酒精灌胃后及科罗索酸治疗后肝脏组织的病理变化,并通过全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中转氨酶的水平。4.检测体内各组的胞浆及线粒体中的细胞色素C的含量：分别收集各组肝脏组织的胞浆及线粒体部分,检测胞浆及线粒体中细胞色素C的含量。5.检测体内各组凋亡蛋白的表达情况：分别提取各组肝脏组织的蛋白,通过western blot检测SOCE相关蛋白分子及各凋亡蛋白的表达量。结果：1.酒精灌胃对于肝脏组织损伤的影响：酒精灌胃组大鼠体重上升较对照组减慢,HE染色发现酒精灌胃组大鼠肝脏损伤严重,肝细胞脂肪变,炎细胞浸润及肝细胞坏死较对照组明显增多。血清中ALT、AST较对照组明显升高,且AST/ALT的比值明显大于1。2.酒精灌胃对于SOCE相关蛋白分子表达的影响：与生理盐水灌胃组相比,酒精灌胃明显增加了SOCE相关蛋白分子STIM1、Orai1的表达。3.科罗索酸对于肝脏组织损伤的影响：与酒精灌胃组相比,科罗索酸组的大鼠肝脏组织的损伤(肝细胞脂肪变、炎细胞浸润、肝细胞坏死)明显减轻；血清中的转氨酶水平也明显降低。4.体内阻断SOCE对细胞色素C的影响：与酒精灌胃组相比,给予科罗索酸后胞浆中细胞色素C的含量明显减少,而线粒体中细胞色素C的含量相对增加,说明阻断SOCE可明显减少线粒体中的细胞色素C的释放。5.体内阻断SOCE对于STIM1、Orai1及各凋亡蛋白表达的影响：与酒精灌胃组相比,科罗索酸在降低SOCE相关蛋白分子STIM1、Orai1蛋白表达的同时,也降低了酒精刺激增加的Bax/Bcl-2的比值,减少了caspase3的激活。结论：1.酒精灌胃组中SOCE相关蛋白分子STIM1、Orai1的表达较正常对照组明显增加,给予科罗索酸后STIM1、Orai1的表达减少,肝脏组织损伤明显减轻,转氨酶明显下降,说明SOCE可能参与酒精导致的SD大鼠肝脏组织的损伤。2.酒精灌胃组大鼠肝脏中细胞色素C释放增加,Bax/Bcl-2的比值增高,caspase3激活增加。而科罗索酸可明显减轻上述过程,进一步说明在酒精性肝病中SOCE可能通过诱导凋亡而导致肝脏组织的损伤。