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脊髓损伤(Spinal cord injury)是由于外界直接或间接因素导致相应损伤节段出现各种运动、感觉和括约肌功能障碍。脊髓损伤后,病灶内聚集的成纤维细胞(Fibroblasts)活跃增殖并分泌Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)等细胞外基质(Extracellular matrix)形成纤维瘢痕,纤维瘢痕跟胶质瘢痕一起在脊髓损伤早期可以防止炎症细胞向周边组织扩散和损伤面积的扩大,而在脊髓损伤晚期则成为致密理化屏障,阻碍神经组织的再生修复。miR-124作为中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)中含量最丰富的microRNA(miRNA),能够参与神经系统发育、细胞分化、代谢和修复等重要的生理和病理过程并发挥极其重要的作用。研究发现,脊髓损伤发生时,损伤部位组织中miRNA表达谱发生明显改变,其中miR-124是下调最显著的miRNA之一。脊髓损伤后,miR-124在形成纤维瘢痕的成纤维细胞中的表达如何,以及对纤维瘢痕的形成有无抑制作用未见报道。本文旨在探究,高表达miR-124对脊髓损伤部位纯化分离的成纤维细胞增殖和Collagen Ⅰ表达的影响及机制,为应用外源miR-124抑制纤维瘢痕形成促进脊髓损伤修复的研究提供科学依据和研究数据,为应用miR-124治疗脊髓损伤带来新的研究方向。本研究在制作大鼠钳夹脊髓损伤模型之后,进行了以下研究:①通过组织免疫荧光分析大鼠脊髓损伤后损伤部位成纤维细胞标志物的表达,应用qRT-PCR检测miR-124的表达变化;②建立了从大鼠脊髓损伤部位分离纯化培养成纤维细胞的方法,通过细胞免疫荧光及骨细胞和脂肪细胞诱导实验对其进行鉴定,miR-124与神经诱导培养液相结合诱导其向神经元分化并进行鉴定,并用qRT-PCR检测培养的成纤维细胞中miR-124的表达变化。③确定miR-124-3p mimic的最佳转染浓度并处理成纤维细胞,通过CCK-8检测过表达miR-124对成纤维细胞增殖的影响,用Western blot检测过表达miR-124对成纤维细胞中Collagen Ⅰ蛋白表达的影响。④结合RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和双荧光素酶报告基因实验,确定PTBP1是否为miR-124的靶基因;⑤通过si-PTBP1干扰成纤维细胞中PTBP1的表达,应用qRT-PCR分析Collagen Ⅰ基因的表达,Western blot检测分析Cyclin D1蛋白和Collagen Ⅰ蛋白的表达。结果:(1)组织免疫荧光结果显示,脊髓损伤组织中心形成了空洞样病灶,病灶周边由里往外形成表达Collagen Ⅰ、Fibronectin等标志物的纤维瘢痕及表达GFAP的胶质瘢痕,纤维瘢痕还高表达PTBP1;qRT-PCR结果证实,与正常脊髓组织相比,脊髓损伤后损伤脊髓组织中miR-124的表达量显著降低,而Collagen Ⅰ、Sox9和PTBP1的基因水平表达量均显著升高。(2)从大鼠脊髓损伤部位分离获得原代细胞并进行纯化培养,镜下观察细胞形态呈梭形、鱼群状,呈成纤维细胞样的细胞形态,通过细胞免疫荧光检测到分离纯化的细胞强阳性表达成纤维细胞标志物Collagen Ⅰ、Fibronectin、Vimentin、PDGFR-β、NG-2;阴性表达星形胶质细胞标志物GFAP及少突胶质细胞标志物Sox10,结果证明纯化培养的细胞为成纤维细胞,纯度达到约90%,此外,成纤维细胞高表达PTBP1;向骨细胞诱导28天时,茜素红染色无钙盐沉积,向脂肪细胞诱导21天时,油红O染色无脂滴形成,证明所获得的成纤维细胞不具有成骨成脂的干细胞分化特性;向神经元诱导7天时,细胞形态符合神经元细长突起的特征,细胞免疫荧光分析发现其表达DCX和MAP-2蛋白,证明在miR-124和小分子化合物诱导液的联合作用下成纤维细胞向神经元分化;qRT-PCR结果证实,脊髓损伤部位成纤维细胞中miR-124的表达量显著降低。(3)通过 qRT-PCR 检测到将 25、50、100 nM miR-124-3p mimic 转染成纤维细胞后,细胞中miR-124含量依次提高约81、119、163倍;CCK-8结果证实,提高细胞中miR-124含量后成纤维细胞增殖能力显著降低;Western blot结果表明,提高细胞中miR-124水平后,成纤维细胞中Collagen Ⅰ及Sox9的蛋白表达水平均显著下调(P<0.01)。(4)RT-PCR、qRT-PCR 及 Western blot 结果显示,提高细胞中 miR-124水平,PTBP1基因和蛋白表达水平均显著下调(P<0.001),通过TargetScanHuman网站预测到PTBP1 mRNA的3’UTR序列上存在miR-124的结合位点,结合双荧光素酶报告基因实验证实,在293T细胞中PTBP1是miR-124的靶基因;Western blot结果显示,siRNA干扰PTBP1基因表达后,Cyclin D1蛋白表达水平显著降低(P<0.001);qRT-PCR及Western blot结果显示,siRNA干扰PTBP1基因表达后,Collagen Ⅰ基因(P<0.05)和蛋白(P<0.01)表达水平均显著升高。结论:(1)大鼠脊髓损伤后,损伤中心部位存在主要由成纤维细胞形成的纤维瘢痕;(2)提高miR-124含量抑制损伤脊髓部位来源成纤维细胞的增殖,提示miR-124可能减少纤维瘢痕的形成并促进脊髓损伤的修复;(3)miR-124可能通过抑制其靶基因PTBP1蛋白的表达来降低损伤脊髓部位来源成纤维细胞的增殖,但PTBP1的抑制不能减少Collagen Ⅰ的表达,推测miR-124可能通过其他机制途径减少损伤脊髓部位来源成纤维细胞中Collagen Ⅰ 的表达。