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脑卒中(约4/5是缺血性脑卒中)是全球致残的主要因素,是我国成年人致死致残的主要原因。脑卒中幸存者常遗留不同程度的精神障碍,感觉障碍、运动障碍等神经功能缺陷,导致生活不能自理需要有人长期看护,给家庭和社会带来了巨大的负担。因此,亟待寻求有效的脑卒中防治措施,尤其是卒中后如何改善患者的神经功能缺陷,提高康复率和生存质量迫在眉睫。我们的前期研究表明电针预处理有效的减少了脑梗死容积,提高了神经行为学评分,具有神经保护作用。然而电针参与中枢神经系统调控,发挥作用的机制复杂,目前仍不完全清楚。微小RNAs(Micro RNAs,Mi RNAs)是一类由18-24个核苷酸组成的小分子非编码RNA,与大脑发育和功能密切相关,以碱基互补配对的原则作用于靶基因发挥生物学效应。我们通过基因芯片筛查发现脑缺血再灌注损伤后缺血半暗带区有20种差异性表达的Mi RNAs,其中mi R-132的表达显著下调,且电针穴位治疗上调了脑缺血半暗带区mi R-132的表达水平。那么mi R-132的表达变化是否能够影响脑缺血再灌注损伤,是否能够影响电针治疗的效果,以及发挥作用的具体的机制是什么并不清楚。在本研究中,我们构建SD(Sprague-Dawley)大鼠大脑中动脉梗阻(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型和原代神经元氧糖剥夺(Oxygen glucose deprivation,OGD)模型,利用基因转染、分子生物学等技术方法,观察电针治疗脑缺血再灌注损伤后,缺血半暗带区mi R-132的表达变化。经过基因信息数据库查询和双荧光素酶报告基因检测系统确定mi R-132的靶基因。探索mi R-132同靶基因结合在电针治疗中的作用及机制,并采用多种神经行为学方法进一步评估mi R-132的表达变化对电针穴位治疗脑缺血再灌注损伤后神经行为学功能恢复的影响。本研究为缺血性脑卒中后神经功能恢复的治疗提供了新的干预靶点和新的治疗策略。【目的】1.观察电针治疗脑缺血再灌注损伤后皮层半暗带区mi R-132的表达变化。2.观察mi R-132的表达变化在电针治疗脑缺血再灌注损伤中发挥的作用。3.预测并确定mi R-132下游的靶基因及其mi R-132与靶基因结合在电针治疗中发挥作用的机制。4.通过多种神经行为学评估方法观察电针调控mi R-132对脑缺血再灌注损伤后神经行为学功能恢复的影响。【方法】1.构建大鼠MCAO模型,大脑中动脉梗阻缺血90 min,恢复再灌注后24 h电针治疗,每天一次,30min/d,连续5 d。2.构建原代神经元OGD损伤模型,分离原代神经元,实施去氧去糖30min,复糖复氧24 h后评估。3.离体和在体转染脂质体包被的mi R-132 mimic和mi R-132 inhibitor调控mi R-132的表达水平。4.用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测原代神经元和皮层半暗带区中mi R-132的表达水平。5.双荧光素酶基因表达报告系统确定mi R-132的下游靶基因,用western blot检测其在原代神经元和皮层半暗带区的表达水平。6.用ELISA法检测细胞释放乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的水平和CCK-8(cell counting kit-8)试剂盒检测细胞活力评估神经元的损伤程度。7.用免疫荧光标记神经突起(轴突:Tau,树突:MAP2,神经纤维:NF200)和靶基因表达,评估转染mi R-132 mimic和mi R-132 inhibitor后对OGD损伤的神经突起长度的影响。8.用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色评估脑梗死容积,用Garcia评分量表行神经功能缺损评分。9.用前肢放置实验、肢体放置实验、身体侧摆实验、转轴实验评估电针调控mi R-132改善神经功能的恢复情况。【结果】1.电针治疗对大鼠脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用,上调了大鼠脑缺血半暗带区mi R-132的表达。Garcia评分显示:与Sham组比,MCAO组大鼠神经功能评分明显降低(P<0.001);而电针治疗显著提高了MCAO引起的神经功能评分的降低(P<0.01)。TTC染色结果显示:与Sham组比,MCAO组大鼠出现了明显的脑梗死(P<0.001);与MCAO组比,电针治疗降低了大鼠脑梗死容积(P<0.01)。QRT-PCR结果显示:与Sham组相比,MCAO组大鼠mi R-132的表达水平显著降低(P<0.05);与MCAO组比,电针治疗显著增加了脑缺血半暗带区mi R-132的表达(P<0.01)。2.mi R-132参与电针治疗脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。TTC染色结果显示:上调mi R-132表达,降低了大鼠缺血半暗带区脑梗死容积(P<0.01),Garcia评分显示增加了神经功能评分(P<0.01),而下调mi R-132的表达则部分逆转了电针治疗的有益的作用。上调原代神经元中mi R-132的表达,减少OGD损伤后原代神经元LDH释放水平(P<0.05),增加神经元的活力(P<0.05)。3.Mi R-132靶向抑制SOX2的表达参与电针的神经保护作用,促进OGD损伤后的神经突起生长。检索mi RNAs基因数据库筛选mi R-132可能的靶基因,通过双荧光素酶报告基因检测系统证实了mi R-132直接作用的靶基因是SOX2。Western blot结果进一步显示:mi R-132抑制缺血半暗带区SOX2蛋白的表达(P<0.01),下调mi R-132的表达,明显逆转了电针对SOX2的作用(P<0.05);mi R-132抑制OGD损伤后原代神经元中SOX2的表达(P<0.05);上调原代神经元中mi R-132的表达,靶向抑制SOX2,显著促进OGD诱导的神经突起生长,免疫标记的树突(P<0.001)、轴突(P<0.01)、神经纤维(P<0.001)长度增加。4.电针通过上调mi R-132改善脑缺血再灌注损伤后的神经行为功能恢复。前肢放置实验结果显示:在MCAO后7 d、14 d、28 d,电针治疗显著降低了大鼠左侧前肢放置不成功的比率(P<0.05,P<0.01或P<0.001);肢体放置实验结果显示:在MCAO后7 d、14 d、28 d,电针治疗显著增加了大鼠肢体放置实验的评分(P<0.05或P<0.01);身体侧摆实验结果显示:在MCAO后7 d、14 d、28 d,电针治疗显著降低了大鼠左侧侧摆的发生率(P<0.05);转轴实验结果显示:在MCAO 14d、28 d,电针治疗显著增加了大鼠在转轴停留的时间(P<0.05),而下调mi R-132则逆转了电针治疗的这些有益的作用。【结论】电针治疗通过上调大脑皮层中mi R-132的表达靶向抑制SOX2,减轻神经元损伤,促进神经突起的生长,减少脑梗死容积,促进脑缺血再灌注损伤后神经行为功能恢复。本研究为电针在脑缺血再灌注损伤中发挥的神经保护作用提供了新的理论依据,为脑卒中的防治提供了新的作用靶点。