论文部分内容阅读
经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)是冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)的主要治疗方法之一。以雷帕霉素(rapamycin,RAPA)为代表的药物洗脱支架(drug-eluting stents,DES)能够抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的增殖迁移,同时,也抑制内皮细胞的修复。促进损伤内皮细胞的再生,尽快恢复内膜完整性是预防PCI术后支架内再狭窄(in-stentrestenosis,IRS)及血栓发生的关键措施之一。益气凉血生肌方由生黄芪、丹参、金银花、丹皮四味中药组成。前期临床研究提示益气凉血生肌方能降低PCI术后联合不良心血管事件的发生率及降低ISR的发生趋势。现代药效学实验证明单味药物具有抗炎、清除氧自由基、抗氧化应激损伤、改善能量代谢等作用,而这些作用可能是益气凉血生肌方促进内皮损伤修复的机制。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex-1,mTORC1)信号通路是RAPA调节内皮细胞和VSMCs增殖与迁移重要途径,缺少能量时,三磷酸腺苷(adenosinetiphosphate,ATP)/一磷酸腺苷(adenosinemonophosphate,AMP)比值降低,一磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)激活可抑制mTORC1。mTORC1信号传导至下游两个独立靶蛋白,即p70 核糖体蛋白 S6 激酶(p70ribosomal protein S6 kinase,p70S6K)、4E 结合蛋白 1(4E binding·protein1,4E-BP1),调节哺乳动物细胞生长。综上所述,我们提出益气凉血生肌方促进损伤血管内皮细胞修复的机制可能是通过减少氧化应激、改善能量代谢,从而调节mTORC1信号传导通路促进内皮细胞增殖的假说。方法:实验一:采用体外实验的方法,对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)进行缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)造模,按照干预情况分为对照组、模型组、中药组(益气凉血生肌方含药血清干预)、西药组(阿托伐他汀含药血清干预)、中西药组(益气凉血生肌方+阿托伐他汀含药血清干预);采用CCK-8法检测细胞增殖率、划痕实验检测细胞迁移距离、透射电镜观察细胞超微结构变化、荧光探针法检测活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量、比色法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、WST-1法检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力、质谱法检测ATP、AMP含量,western检测AMPK,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR),p70S6K,4E-BP1蛋白及磷酸化表达水平。实验二:采用体外实验的方法,对HUVECs进行H/R造模,并在复氧时给予RAPA,按照干预情况分为空白对照组、模型组、RAPA组、中药+RAPA组(益气凉血生肌方含药血清联合RAPA干预)、西药+RAPA组(阿托伐他汀含药血清联合RAPA干预)、中西药+RAPA组(益气凉血生肌方+阿托伐他汀含药血清联合RAPA干预);采用CCK-8法检测细胞增殖率、划痕实验检测细胞迁移距离,western检测AMPK,mTOR,p70S6K,4E-BP1蛋白及磷酸化表达水平。结果:实验一:益气凉血生肌方对H/R损伤内皮细胞增殖的机制研究:①H/R损伤后,含药血清浓度为10%时,中药组、西药组、中西药组内皮细胞与模型组相比细胞增殖率均升高(P<0.05或P<0.01),且中西药组细胞增殖率高于中药组和西药组(P<0.05);②划痕实验结果表明,中西药组细胞与模型组相比迁移距离加大(P<0.01);③透射电镜观察结果表明,中药组、西药组和中西药组损伤内皮细胞与模型组相比细胞核边界更清楚,线粒体结构更完整;④H/R损伤后,中药组、西药组、中西结合组细胞与模型组相比ROS、MDA含量下降(P<0.05或P<0.01),SOD含量显著升高(P<0.01);⑤H/R损伤后,中药组、中西药组细胞与模型组相比ATP/AMP明显升高(P<0.05或P<0.01),且中西药组效果优于西药组(P<0.01);⑥western结果表明,模型组p-AMPK/AMPK下降(P<0.01),p-mTOR/mTOR,p-p70S6K/p70S6K,p-4E-BP1/4E-BP1 升高(P<0.01),中药组、中西药组p-AMPK/AMPK较模型组明显降低(P<0.05),中西药组较西药组更低(P<0.05),中药组、西药组、中西药组与模型组相比p-mTOR/mTOR,p-p70S6K/p70S6K,p-4E-BP1/4E-BP1 升高(P<0.05 或P<0.01)。实验二:益气凉血生肌方联合RAPA对H/R损伤内皮细胞增殖的干预研究:①H/R损伤后,中西药+RAPA组内皮细胞增殖率显著高于RAPA组(P<0.05);②H/R损伤后,中药+RAPA组、中西药+RAPA组与RAPA组相比p-AMPK/AMPK明显降低(P<0.05),但中药+RAPA组、西药+RAPA组、中西药+RAPA组与RAPA组相比p-mTOR/mTOR,p-p70S6K/p70S6K,p-4E-BP1/4E-BP1 没有统计学差异(P>0.05)。结论:①益气凉血生肌方可改善H/R损伤内皮细胞能量代谢、减少氧化应激,抑制AMPK激活,调节mTORC1信号通路,发挥保护内皮细胞并促进细胞增殖的作用;②益气凉血生肌方与阿托伐他汀联合治疗可减轻RAPA对受损内皮细胞增殖的抑制作用,其机制与改善内皮细胞能量代谢,抑制AMPK激活有关。