背景葡萄膜炎是一种累及葡萄膜、视网膜、视网膜血管和玻璃体的疾病,严重威胁患者的视力。它多发于青壮年,并可导致不可逆的盲目。Behcet’s病是我国致盲率最高的葡萄膜炎类型之一。它是一种多系统受累的自身炎症性疾病,复发性葡萄膜炎、皮肤损害、口腔和生殖器溃疡是此病的主要特征。Behcet’s病主要发生于“丝绸之路”沿线国家,如中国、土耳其和日本。根据以往文献报道,自身免疫反应或自身炎症反应在此病的发生中起着尤为重要的作用。调控异常的自身免疫反应或自身炎症反应是防治Behcet’s病的有效策略。白介素37(IL-37)是最近发现的IL-1家族新成员,它在免疫反应中起着重要的负性调控作用。在对动物模型的研究中发现,IL-37能够显著抑制右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎和脂多糖诱导的休克模型的发生。B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)是另一种抑制性分子,其广泛表达于人体内的免疫细胞表面,尤其是B细胞和T细胞表面。BTLA能够通过与其配体单纯疱疹病毒进入介导子(HVEM)相互作用从而抑制过度活化的免疫细胞反应。对BTLA基因敲除鼠的研究发现,与野生型小鼠相比,BTLA基因敲除鼠更易发生实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和呼吸道炎症。尽管IL-37和BTLA均被认为是调节自身免疫反应或自身炎症反应的抑制性分子,但它们是否参与了Behcet’s病的发生以及是否对Behcet’s病具有防治作用尚不清楚。基于以上研究背景,本课题主要对以下两个问题进行了研究:(1)IL-37和BTLA是否参与了Behcet’s病的发生和发展?(2)如果这两个分子参与疾病的发生,它们在疾病发生中的作用机制是什么?探讨以上两个问题,将有可能阐明Behcet’s病的发生机制,并提供防治Behcet’s病的新靶点。第一部分IL-37在Behcet’s病发病机制中的作用研究目的:IL-37在固有免疫反应中起着重要的调节作用。在本部分研究中,我们探讨IL-37在Behcet’s病患者中的表达水平,以及它在此病的发病过程中可能的作用机制。方法:1.利用荧光定量PCR(RT-PCR)和流式细胞术检测IL-37在Behcet’s病患者和正常人外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达。2.利用酶联免疫吸附技术探讨重组人IL-37对单核细胞诱导的树突状细胞(DCs)分泌细胞因子的影响。3.利用流式细胞术探讨IL-37对DC表面标志的表达、活性氧的水平和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的磷酸化的作用。4.利用ELISAs和流式细胞术探讨IL-37预处理的DC对Th17细胞和Th1细胞分化的作用。结果:1.与正常对照相比,活动期Behcet’s病患者体内IL-37的m RNA水平和蛋白水平均有显著下降。2.IL-37能够显著抑制Behcet’s病患者和正常人体内DC分泌促炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α,同时促进调节性细胞因子IL-27的产生。3.IL-37对DC细胞内活性氧的产生以及MAPK的三个信号通路ERK1/2、JNK和p38 MAPK的磷酸化均有明显的抑制作用。4.IL-37预处理的DC能够显著抑制Th17细胞和Th1细胞分化,同时抑制CD4+T细胞分泌IL-17和IFN-γ。5.IL-37对DC细胞表面的五种表面标志CD83、CD86、CD80、CD40和HLA-DR没有明显作用,对DC分泌IL-10也没有影响。结论:我们的研究发现在活动性Behcet’s病患者体内IL-37的表达显著降低,可能导致其无法有效发挥对DC分泌促炎性细胞因子和产生活性氧的抑制作用以及对Th17细胞和Th1细胞分化的调节作用,从而参与到Behcet’s病的发生。第二部分BTLA在Behcet’s病发病机制中的作用研究目的:Behcet’s病是一种严重损害视力的疾病。已有研究报道Th17细胞和Th1细胞的过度激活与此病的发生密切相关。BTLA已被证实在免疫反应中起着重要的调节作用。本研究主要探讨BTLA的活化是否能够调节Behcet’s病中异常的免疫反应,以及它在此病的发病过程中的作用及其可能机制。方法:1.抽取活动期Behcet’s病患者和健康对照的外周血,分离PBMCs。利用磁珠分选CD4+T细胞或CD14+单核细胞,利用流式细胞术将CD4+T细胞分选为BTLAhi和BTLAlo两群细胞。2.利用RT-PCR和流式细胞术检测Behcet’s病患者和健康对照体内PBMCs表面BTLA的表达水平;利用流式细胞术检测Behcet’s病患者和健康对照体内PBMCs不同亚群表面BTLA的表达情况。3.利用流式细胞术检测患者和健康对照体内Th17细胞和Th1细胞比例,以及产生IL-17和IFN-γ的BTLAhiCD4+T细胞和BTLAloCD4+T细胞比例。4.利用BTLA特异性激动剂活化BTLA,并评价其对患者和健康对照体内IL-17、IFN-γ和IL-22分泌的影响和对Th17细胞、Th1细胞比例的影响。5.利用流式细胞术和ELISAs检测BTLA活化对DC诱导的Th17细胞和Th1细胞免疫反应的影响。6.利用流式细胞术和ELISAs评价BTLA活化对DC表面标志物的影响及对DC分泌Th17细胞、Th1细胞活化相关细胞因子的影响。结果:1.活动期Behcet’s病患者体内BTLA m RNA及蛋白水平显著低于健康对照;患者体内BTLA在CD4+T细胞表面的表达也明显降低。2.活动期Behcet’s病患者体内Th17细胞和Th1细胞比例均显著高于健康对照,活动期Behcet’s病患者Th17细胞和Th1细胞免疫反应过度活化。3.经anti-CD3和anti-CD28预处理后,患者体内的BTLAloIL-17+细胞比例显著高于正常人,同时BTLAloCD4+T细胞表达更多IL-17和IFN-γ。4.BTLA特异性激动剂活化BTLA后,患者和健康对照的CD4+T细胞分泌的IL-17、IL-22和IFN-γ均显著降低,同时患者和健康对照体内的Th17细胞和Th1细胞比例也明显下降。5.活化BTLA明显抑制DC细胞诱导的Th17细胞和Th1细胞活化,并抑制CD4+T细胞分泌IL-17和IFN-γ。6.活化BTLA显著抑制DC表面与T细胞活化相关的分子CD40的表达,同时抑制DC分泌Th17细胞和Th1细胞活化相关细胞因子IL-1β、IL-6、IL-23和IL-12p70。结论:我们的研究发现,活动性Behcet’s病患者体内BTLA表达降低与Th17细胞和Th1细胞的过度活化密切相关。BTLA的表达降低可能影响其对Th17细胞和Th1细胞免疫反应以及DC功能的调节作用,从而参与到疾病的发生和复发。利用BTLA特异性激动剂活化BTLA可能成为防治Behcet’s病的一个新策略。