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2013年初,新型禽流感病毒H7N9的跨种属传播,致使中国数百人感染、死亡,对人类的生命安全造成了极大地威胁。本实验研究了H7N9 NS1蛋白对病毒复制以及宿主先天性免疫的影响。通过对NS1蛋白4个氨基酸位点进行突变,研究了H7N9NS1定点突变对其功能的影响。为抵御H7N9亚型禽流感病毒感染以及研制抗病毒药物提供新的思路和理论基础。本实验将A/Shanghai/2013(H7N9)株的NS 1蛋白构建到pNL-CMV-GFP的真核表达载体中,将构建的pNL-NS1转染293T细胞,并用甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)感染细胞,研究了在流感病毒感染过程中,H7N9 NS1对病毒复制以及宿主先天性免疫的影响;通过70、143、178、212位氨基酸定点突变,分别构建了pNL-NS1-E70K、pNL-NS1-T143A、pNL-NS1-I178V、pNL-NS 1—S212P 的重组质粒。将 pNL-NS1-WT 和 pNL-NS1-1178V 转染293T 细胞,CHX处理细胞,分别于处理后0h、6h、12h、18h、24h、36h收集细胞样品,检测NS1-I178V蛋白的半衰期;将已构建的pNL-NS1-E70K、pNL-NS1-T143A、pNL-NS1-S212P转染293T细胞,之后感染流感病毒A/WSN/33(H1N1),检测NS1-E70K、NS1-T143A、NS1-S212P对宿主先天性免疫的影响。研究结果显示,H7N9 NS1蛋白能够显著提高流感病毒在真核细胞内的复制量、促进病毒蛋白的合成,增强病毒的致病力;在感染流感病毒的细胞中,H7N9 NS1降低了RIG-I及其下游因子IPS-1、转录因子NF-κB的活性,并限制干扰素以及抗病毒蛋白的合成分泌。H7N9NS1通过阻断RIG-I介导的信号通路而拮抗宿主细胞的先天性免疫。本实验成功构建了 H7N9亚型禽流感病毒NS1蛋白4个突变体的真核表达重组质粒:pNL-NS1-E70K、pNL-NS1-T143A、pNL-NS1-I178V以及pNL-NS1-S212P。NS1-I178V在CHX处理第18h,蛋白表达量下降75%,而NS1-WT仅下降36%。结果表明,H7N9 NS1蛋白I178V的突变显著降低了NS1的蛋白稳定性;并且与野生型NS1相比,NS1-S212P使细胞中干扰素和抗病毒蛋白的表达量均显著上升。S212P的突变削弱了NS1抑制宿主细胞抗病毒应答的功能。NS1-E70K、NS1-T143A则没有明显改变NS1的主要功能。上述实验结果表明,H7N9亚型禽流感病毒NS1蛋白增加流感病毒的复制量,促进病毒蛋白合成;通过阻断RIG-I介导的信号通路高效抑制宿主细胞的先天性免疫;NS1的178位氨基酸对H7N9 NS1蛋白的稳定性起重要作用;212位氨基酸是NS1抑制宿主先天性免疫的关键位点;70、143位氨基酸突变对其功能不产生明显影响。