肾小球肾炎是临床常见病,其中系膜细胞(mesangial cell, MsC)的活化、增生是多种类型肾小球肾炎的特征表现之一。MsC活化后分泌大量细胞外基质(extracellular matrix, ECM),后者异常沉积在肾小球内,可促使肾小球肾炎进展为肾纤维化、硬化,最终可导致肾功能衰竭。在肾小球肾炎早期,诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)即可在炎症因子的刺激下产生,分解精氨酸产生大量一氧化氮(NO)气体,而NO又可极大地增强炎症因子诱导的MsC中iNOS的表达,此作用形成一个正反馈,导致NO大量生成和积聚。醛糖还原酶(aldose reductase, AR)是多元醇通路的限速酶,属于NADPH依赖性醛-酮还原酶家族成员。本课题组前期研究已经证实,AR可以通过调控转录因子AP-1促进MsC增殖,可以调控转化生长因子β1(tansforming growth factorβ1,TGF-β1)下游的丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)通路及转录因子AP-1的活性从而影响ECM的表达。提示AR可以通过影响信号通路从而影响下游信号分子的产生。因此本课题将研究肾小球肾炎早期过程中AR对炎症相关酶iNOS的影响,并对其可能的机制进行初步探讨。第一部分干扰AR对TNF-α诱导HMC表达iNOS的影响1.1 TNF-α对HMC表达iNOS和AR的影响目的通过比较正常人系膜细胞(human mesangial cell, HMC)在肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor a, TNF-a)作用前后表达iNOS的差异,观察炎症过程中iNOS的表达特点。方法体外培养HMC,待细胞生长至约70-80%融合,分别以0,2,4,6,7,8ng/ml浓度的TNF-α刺激细胞；以及6ng/ml的TNF-α刺激不同时间,分别与0,1,3,6,12,24小时收细胞提取胞浆蛋白,Western blot检测iNOS及AR的表达。结果正常HMC的iNOS基础表达量少,用TNF-α刺激后,可大量表达,在6ng/ml的TNF-α刺激12小时时表达量最高,而在此过程中AR表达并未发现明显变化。结论TNF-α可以诱导HMC高表达iNOS。1.2 AR-siRNA对TNF-α诱导HMC表达iNOS的影响目的通过比较正常HMC,经过AR-siRNA处理后的HMC在TNF-α作用前后表达iNOS的差异,明确干扰AR对TNF-α诱导iNOS表达的影响。方法体外培养HMC,待细胞生长至约30-40%融合,用AR-siRNA预处理HMC48h,再以6ng/ml浓度的TNF-α刺激细胞12h,收细胞提取胞浆蛋白,Western blot及Real-time PCR检测iNOS及AR在蛋白和mRNA水平的表达。结果干扰AR可以抑制TNF-α诱导HMC表达iNOS,且此抑制作用从核酸水平即开始。结论AR表达量下降可以降低炎症过程中iNOS表达。1.3 AR-siRNA对TNF-α活化NF-κB上游IKK-IκB信号通路的影响目的观察TNF-α促进HMC中核转录因子(nuclear factorκB, NF-κB)上游IKK-IκB信号通路的变化情况,初步探讨干扰AR影响HMC中iNOS表达的机制。方法体外培养HMC,待细胞生长至30-40%融合,预先AR-siRNA处理细胞48小时,然后给以TNF-α刺激,在0,30,60,120min收集细胞。Western blot检测上游通路IKK-κB磷酸化变化情况。结果HMC在TNF-α刺激下30min即可导致IKKα/β磷酸化增强,60min时达到高峰,而总的IKKα、IKKβ未见明显改变。与之对应,TNF-α刺激HMC后,30min时开始出现IκB磷酸化增强,60min达高峰,后维持一较高水平。与之对应,总的IκB随p-IκB的增强而减少。AR-siRNA+TNF-a组与TNF-α组相比,可见上述IKKα/β磷酸化、IκB磷酸化增强的程度均有所降低。结论干扰AR可抑制HMC中TNF-α导致的NF-κB活化上游IKK-IκB信号通路磷酸化。1.4 AR-siRNA对TNF-α活化NF-κB的影响目的观察TNF-α促进HMC中NF-κB的活化情况,研究干扰AR对TNF-α导致的NF-κB活化的影响。方法体外培养HMC,待细胞生长至30-40%融合,预先AR-siRNA处理细胞48小时,然后给以TNF-α刺激,在3h时收集细胞。按照Sigma核蛋白提取试剂盒提供的方法提取细胞核蛋白。EMSA方法测定干扰AR对TNF-α所致的NF-κB活化的影响。结果正常HMC在TNF-α刺激下,NF-KB活性增强。干扰AR可显著抑制TNF-α诱导的NF-κB的活化,此抑制作用在3h时表现最明显。结论干扰AR可抑制HMC中TNF-α导致的NF-κB活化及其上游IKK-IκB信号通路磷酸化。考虑到NF-κB活化是iNOS表达的重要转录调节因子,因此认为AR影响iNOS的表达可能与抑制转录因子NF-κB的活化状态而实现的。第二部分转染AR对TNF-α诱导HMC表达iNOS的影响2.1转染AR对TNF-α诱导HMC表达iNOS的影响目的通过比较正常HMC,以及经过转染AR处理后的HMC在TNF-α作用前后表达iNOS的差异,明确转染AR对TNF-α诱导iNOS表达的影响。方法体外培养HMC,待细胞生长至约70-80%融合,AR质粒转染细胞48小时,再给以TNF-α刺激,12小时收细胞,提取胞浆蛋白,分别以Western blot法观察iNOS及AR蛋白表达变化,Real-time PCR检测iNOS及AR mRNA水平变化。结果HMC的iNOS基础表达量少,给以TNF-α刺激后可大量表达,而在此过程中AR表达并未发现明显变化。预先转染以AR表达质粒作用后,TNF-α刺激细胞表达iNOS的过程均得以增强,且在mRNA水平和蛋白水平上均可观察到此增强效应。结论转染AR可增强TNF-α诱导HMC表达iNOS,且此作用是从核酸水平即开始的。说明AR的变化可影响炎症过程中HMC iNOS的表达。2.2转染AR对TNF-α活化NF-κB上游IKK-IκB信号通路的影响目的观察TNF-α促进HMC中NF-KB上游IKK-IκB信号通路的变化情况,初步探讨转染AR影响HMC中iNOS表达的机制。方法体外培养HMC,待细胞生长至70-80%融合,预先用AR质粒预先处理细胞48小时,然后给以TNF-α刺激,在0,30,60,120min收集细胞。Westernblot检测上游通路IKK-IκB磷酸化变化情况。结果Western blot法显示在正常细胞中,TNF-α促进IKK及IκB磷酸化,而转染可增强此磷酸化作用。结论转染AR可增强HMC中TNF-α导致的NF-κB上游IKK-IκB信号通路磷酸化。2.3转染AR对TNF-α活化NF-κB的影响目的观察TNF-α促进HMC中核转录因子NF-κB的活化作用,研究转染AR表达质粒对TNF-α导致的NF-κB活化的影响。初步探讨转染AR影响HMC中iNOS表达的机制。方法体外培养HMC,待细胞生长至70-80%融合,转染AR表达质粒处理细胞48小时,然后给以TNF-α刺激,在3h时收集细胞。按照Sigma核蛋白提取试剂盒提供的方法提取细胞核蛋白。EMSA方法测定转染AR对TNF-α所致的NF-κB活化的影响。结果正常HMC在TNF-α刺激下,NF-κB活性在3h时达高峰。转染AR可显著增强TNF-α诱导的NF-κB的活化,此增强作用在3h时表现最明显。结论转染AR可增强HMC中TNF-α导致的NF-κB活化。结论1.在炎症因子TNF-α刺激下,HMC表达iNOS在mRNA和蛋白水平都有增高,且其机制可能与IKK-IκB信号通路,及下游NF-κB的活化有关。2.HMC经AR-siRNA预处理48h后再经TNF-α刺激,经过Real-time PCR和Western blot检测发现,与单纯用TNF-α刺激人系膜细胞组相比,AR的表达量在mRNA和蛋白水平都降低,而iNOS表达未明显升高。Western blot检测IKK-IκB信号通路发现其磷酸化水平降低,EMSA检测发现NF-κB活性也降低。3.转染AR基因的HMC再经TNF-α刺激较单纯TNF-α刺激系膜细胞组AR的表达量在mRNA和蛋白水平都升高,且iNOS表达明显升高。检测IKK-IkB信号通路发现其磷酸化水平升高,NF-κB活性也升高。结合AR转染和干扰两种状态可以说明,AR可以影响TNF-α诱导的HMC中iNOS的表达其机制可能与NF-κB活性变化及上游IKK-IκB信号通路的变化有关。