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利用基因编辑技术改性蚕丝,以及利用家蚕丝腺生物反应器高效生产外源功能蛋白,是养蚕业的重大课题。迄今为止,大量试图直接将编码优良特色丝蛋白纤维的基因导入家蚕的尝试,以及利用丝腺生物反应器生产功能性蛋白质的转基因家蚕,普遍遇到了丝腺发育不良、生殖能力下降、个体生命力低下、外源蛋白质表达水平低等瓶颈问题。利用合适的转基因家蚕模型,研究外源基因表达对家蚕代谢、免疫系统等的影响,对探讨解决上述瓶颈问题具有重要意义。本文利用后部丝腺表达了中部丝腺特异表达的丝胶蛋白SER3的转基因家蚕突变体纯系SER(Ser3+/+)为模型开展研究,突变体SER很好地避免了组织和个体生长发育异常问题,茧丝生产能力甚至超过野生型,但与先天免疫相关的血淋巴黑化能力发生了显著变化。本文深入研究了 SER血淋巴黑化能力变化的机制,探讨了转基因对家蚕黑化免疫及个体抗逆的影响,以期为转基因家蚕安全评估在分子层面提供参考。主要研究结果如下:(1)转基因家蚕后部丝腺表达Ser3,通过抑制酚氧化酶原的表达和活化,提高血淋巴的抗氧化水平,介导血淋巴黑化免疫能力下降。转基因突变体SER 5龄幼虫血淋巴中的酚氧化酶(PO)活性显著降低,导致与先天免疫相关的黑化能力显著变差。首先调查调控黑色素合成的丝氨酸蛋白酶生化通路发现,在5L3d,负调控PO活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂Spn5、Spn6、Spn32,在其来源组织脂肪体中的基因转录水平分别比野生型家蚕上调了 4.24倍、479.36倍和67.84倍,导致血淋巴对蛋白酶K的抑制活性显著增强,进一步抑制了丝氨酸蛋白酶(HP21、PPAE)对酚氧化酶原(PPO)的活性剪切,导致血淋巴中的PO活性降低。表明后部丝腺表达Ser3抑制了 PPO活性剪切。其次,调查血淋巴调控PPO基因表达的转录因子Bmlozenge发现,在5L1d、W期,Bmlozenge在SER家蚕的转录水平比野生型分别上调了 1.37倍、5.13倍,但PPO1、PPO2转录水平却呈极显著低水平表达。提示后部丝腺表达Ser3影响了 PPO的转录调控。最后,调查血淋巴抗氧化代谢发现,在摇摆期,突变体SER血淋巴过氧化氢酶(CAT)和两种超氧化物歧化酶亚型(Cu-SOD、Mn-SOD)基因转录水平上调了 2.47倍、3.10倍和1.20倍,血淋巴CAT活性增加了 3.47倍,诱导血淋巴总抗氧化能力(T-AOC)和抑制超氧阴离子能力(ASAFR)分别升高了 1.13倍和1.34倍,过氧化氢含量降低了 52.4%。表明后部丝腺表达Ser3影响了血淋巴氧化还原代谢,提高了抗氧化能力。(2)转基因家蚕后部丝腺表达Ser3,诱导体液免疫响应,改变个体病菌抵抗力。5龄幼虫血淋巴注射染菌,突变体的生存率显著高于野生型。感染革兰氏阴性菌E.coli和革兰氏阳性菌S.aureus后,野生型全部在幼虫期死亡,突变体能够发育至吐丝结茧的幼虫存活率分别为16.7%和10%。进一步调查SER家蚕参与先天免疫应答的抗菌肽(AMPs)水平,SER幼虫血淋巴AMPs主要来源组织脂肪体中,Moricin,CecropinA,Lebocin,Attacin转录水平显著升高,并且有伴随幼虫丝蛋白质合成速度增加而升高的趋势,在幼虫丝蛋白质合成最旺盛的5L3d,分别比野生型上调了 91.21倍、137.86倍、190.42倍、85.77倍。结论:转基因家蚕突变体后部丝腺表达中部丝腺特异表达的丝胶蛋白SER3,抑制了血淋巴黑色素的合成代谢,导致血淋巴黑化免疫能力下降;诱导上调了血淋巴的氧化应激基础响应水平;通过上调参与体液免疫应答的AMPs水平,增强了抵抗细菌侵染能力。