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枳(Poncirus trifoliata)是柑橘生产中常用的砧木,极抗寒但抗旱性较差,因此提高枳抗旱能力对柑橘产业发展有着重要意义。利用抗逆基因开展基因工程是改良枳抗旱性的一个有效途径。本研究在已克隆鉴定枳精氨酸脱羧酶基因jPtADC的基础上,进一步阐明该基因的抗逆机理,并分离其调控因子,旨在为枳抗逆遗传改良提供更多的基因资源,同时为阐明逆境下多胺积累的转录调控机制奠定基础。主要结果如下：1、PtADC基因抗逆机制研究。拟南芥突变体adc1-1中超表达PtADC，显著增强了转基因材料对脱水、干旱及低温的抗性。在干旱条件下转基因株系保持较高的含水量,且积累的H202和O2-显著降低。同时,转基因植株根变长,与其根尖分生组织变长、细胞增多相一致。2、PtADC基因调控因子分离。脱水诱导PtADC上调表达,且提高细胞内游离多胺的积累。以脱水处理的枳叶片构建cDNA文库,并利用酵母单杂交系统进行筛选。经测序及序列分析,得到两个转录因子,分别命名为PtABF2和PtNAC72。3、PtABF2分析与鉴定。PtABF2蛋白含有一个保守的bZIP结构域,定位于细胞核,受脱水诱导。在正常和脱水条件下,拟南芥突变体abf2中AtADC2基因的表达均低于野生型,多胺积累较少,表明PtABF2可能正调控多胺合成。酵母单杂交系统和双分子荧光素酶活性检测,进一步验证了PtABF2可与PtADC启动子互作。4、PtNAC72分析与鉴定。PtNAC72蛋白包含一个保守的NAM功能域,定位于细胞核,且受脱水诱导。在烟草中超表达PtNAC72,发现正常和脱水条件下,转基因植株中NtADC1和NtADC2的转录水平均显著地低于野生型,且Put、Spd、Spm含量减少。正常条件下,拟南芥突变体nac72中AtADC1和AtADC2的表达水平均高于野生型Col-0,并且AtADC2表达升高得更加显著,表明PtNAC72可能负调控多胺合成。酵母单杂交系统和双分子荧光素酶活性检测分析的结果指出PtNAC72可与PtADC启动子结合,以此调控植物内多胺合成。5、PtsrMYB分析与鉴定。PtsrMYB是一个典型的R2R3MYB转录因子。对PtsrMYB超表达株系进行脱水处理,发现转基因株系中所积累的H202和02-均低于野生型。qRT-PCR分析表明转基因株系中NtADC1和NtADC2的表达水平均高于野生型,同时其细胞内自由态多胺含量显著高于野生型。根据PtADC启动子上MYBR元件的分布将该启动子分割成三个片段,酵母单杂交分析指出PtsrMYB与其中两个片段有非常强的结合能力,表明PtsrMYB可调控PtADC的表达及多胺合成。