背景脑血管疾病是常见病、多发病,病死率与致残率均高,其中缺血性脑血管病是脑血管病中最常见者。近年来,微创的血管腔内介入治疗开始广泛应用于缺血性脑血管病的二级预防,显著降低了卒中的发生率,与颈动脉内膜剥脱术(CEA)疗效相当,而并发症少,对颅内动脉而言与CEA相比具有独到优势。但是支架内再狭窄严重影响了其远期疗效,尤其是在直径较小的颅内血管成形术过程中更易发生。其中血管内皮细胞的损伤是这一系列病理过程的始动因素,且炎性反应起着不可忽视的作用。内皮祖细胞具有高度增殖能力,在体内局部微环境作用下可以发育为适宜局部生长的内皮细胞,行使内皮细胞功能。A20基因能有效促进EPC对抗致病因子损伤并抑制SMC病理性增殖,此外还能下调部分炎症介质从而限制炎症反应。前期研究表明A20能有效阻止组织工程血管的再狭窄。所以研究A20基因修饰的EPC种植支架在防治再狭窄方面具有重要价值。为此,我们首先研制了转基因内皮祖细胞种植支架,由于细胞种植支架存在释放的技术难题,所以我们首先对A20基因修饰的支架进行了动物实验验证。本研究旨在针对再狭窄发生发展的重要机制与环节,通过基因修饰研制新型血管内支架,为防治再狭窄探索新途径。方法1. EPCs培养,鉴定密度梯度离心法获取人脐血单个核细胞,在添加VEGF、bFGF及其它生长因子的M199培养液中诱导培养。倒置显微镜下观察细胞生长、形态学变化;DiI-LDL摄取实验和UEA-I结合观察EPCs是否具有内皮细胞功能特性; CD34、CD133、KDR、vWF等鉴定是否具有内皮细胞表型;透射电镜观察是否具有内皮细胞超微结构;2.转基因内皮祖细胞种植支架的研制A20基因转染EPCs及鉴定;支架偶联CD34抗体的加工(B组),A组为对照组;转基因EPCs种植支架后经流动腔,激光共聚焦显微镜及电镜观察检测细胞改变。3. A20基因修饰血管内支架防治再狭窄的实验研究A20基因修饰支架的加工;活体植入猪的颈动脉,对照组pCDNA3.1 void vectors为A组,A20修饰的支架为B组;A20表达的检测;通过如下指标评判两组之间的效果:颈动脉造影;病理组织形态分析及病理学积分;CD31及PCNA免疫组化检测;凋亡检测;电镜检测内皮细胞及平滑肌细胞。结果1. EPCs培养鉴定1.1细胞体外培养2--3 d后,细胞呈短梭形、多角形等多种形态,有少量细胞突起。培养7--9 d,出现鹅卵石样细胞组成的细胞集落,形成明显克隆。继续培养3--4d集落逐渐散开。重悬后继续培养4—5d细胞逐渐融合,呈现典型的“铺路石”样。1.2 EPCs超微结构:透射电镜观察结果示EPCs内可见特征性的WP小体(Weibel-palade小体),同时可见大量吞噬小泡、线粒体、内质网等细胞器。1.3培养EPCs免疫化学染色:早期CD34、CD133、KDR表达呈阳性,三周后细胞CD34、KDR、vWF表达呈阳性,但CD133表达呈阴性。1.4生物学功能检测:能摄取DiI-acLDL并能结合FITC-UEA-I ,双染色阳性细胞,被认为是正在分化的EPCs,2.转基因内皮祖细胞种植支架的研制2.1 A20成功转染了EPCs,经免疫组化和Western-blot检测阳性。2.2支架上面细胞生长状况培养七天后的支架经激光共聚焦显微镜观察:1)A B两组支架上面细胞均能完全覆盖支架,实现支架的内皮化,且能吞噬LDL,显示生物学功能良好。2)而经过流动腔后A B两组支架上面细胞有所脱落,A组细胞数量明显减少,呈散在分布,没有覆盖支架表面;B组支架上面细胞虽有所脱落,但能基本覆盖支架,两种方法计数提示B组明显多于A组支架上面细胞数量(P<0.01)。3. A20基因修饰血管内支架防治再狭窄的实验研究3.1 A20表达检测:植入支架3天后植入段血管局部有A20表达。3.2血管造影:支架植入3个月,支架内再狭窄在对照组与实验组之间有明显的统计学差异(37.93%±2.11%, 15.03%±1.95%, P < 0.01).3.3病理结果:支架植入3个月,组织形态学测量结果如下:1).内弹力板环绕面积(IEL, mm2) :两组之间无统计学差异。2).管腔面积(LA, mm2)、新生内膜面积(NA,mm2)及面积再狭窄率比较两组之间存在统计学差异。3.4病理学积分:14天时,内皮化积分有统计学差异;14天的损伤积分与3个月时病理学积分无统计学差异。3.5 PCNA检测发现3个月时B组阳性表达呈散在分布,而A组阳性表达明显多于B组(P<0.05)。3.6 3个月时B组凋亡细胞多于A组,有统计学差异。(P<0.05)。3.7电镜:1)扫描电镜:14天时, A组支架表面内皮细胞尚未覆盖完全支架,提示支架没有实现再内皮化,而B组内皮细胞基本覆盖支架,但排列紊乱。3个月时两组均实现了再内皮化。2)透射电镜:14天时,透射电镜观察平滑肌细胞,发现A组分泌型SMC居多,细胞大体呈圆形,细胞器多,提示增殖能力旺盛。而B组收缩型SMC居多,细胞大体呈梭形,细胞器少,增殖能力差。结论1在一定的培养条件下,可从人脐血中分离培养足够数量的EPCs;2 A20基因可成功转染EPCs;3通过偶联抗体的方法可研制转基因内皮细胞种植支架;4 A20基因修饰的血管内支架可有效防治再狭窄。