对虾血蓝蛋白是近年来在对虾等无脊椎动物体内新发现的一种罕见的多功能蛋白，但迄今为止，其功能多样性的分子机制尚不是很清楚。可喜的是，本课题组前期研究发现对虾血蓝蛋白在核酸、蛋白质和蛋白质后修饰等不同水平具有明显的分子多态性，其可能是导致血蓝蛋白具有功能多样性的分子机制之一，然而这些探索还不够深入，尤其是我们最近通过生物信息学研究发现凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基可能还存在多种变体序列。为此，我们进一步对血蓝蛋白大亚基可能存在的变体及其核酸序列、免疫学功能等进行了深入、系统的研究，所获主要研究结果如下：　　1、对虾血蓝蛋白大亚基变体的预测、确定及其进化关系分析　　依据南卡罗莱纳医学院网站（http://www.marinegenomics.org/organisms/）凡纳滨对虾EST数据库，采用序列比对发现，2478条对虾血蓝蛋白大亚基（命名为HcL）EST序列中存在42条与野生型HcL序列同源性为89-93％的序列，根据其核酸序列差异的大小，可分为10种不同的类型。同时，根据这些HcLEST氨基酸差异序列高频出现区间，设计简并引物，通过PCR扩增与测序分析，发现138条序列中存在5条与野生型HcL碱基差异率为7-9％的序列。最后，根据这些差异序列与野生型HcL序列差异的大小，选择3种主要类型的变体即HcLV1、HcLV2、HcLV3和该3种变体的共有序列片段HcLVt进行深入研究。　　在确定对虾血蓝蛋白大亚基确实存在变体的基础之上，进一步以HcLV1为研究对象探索同一变体类型不同序列的进化关系，首先按常规方法对HcLV1进行PCR扩增与克隆，继而任意选取69个HcLV1阳性克隆进行序列测定与序列比对，结果发现，HcLV1可以进一步分为10种类型。进化分析显示，HcLV110种类型的序列可由两条祖先序列（HcLV1-01，HcLV1-02）通过基因重组和碱基突变演化而来。　　由此说明，对虾血蓝蛋白大亚基存在多种变体序列，且这些变体之间存在着进化关系。　　2、2种HcL变体全长cDNA的克隆及序列分析　　基于已获得的HcLV1、HcLV3部分序列，采取RACE技术，克隆HcLV1、HcLV3全序列，发现HcLV1、HcLV3cDNA全长分别为2254、2127bp，编码676、672个氨基酸。经BLAST比对，HcLV1、HcLV3氨基酸序列与HcL序列存在86、90％的相似性。两者均具有血蓝蛋白的典型结构，包括铜离子结合区域，保守His位点和Ig-like区等。该结果进一步证实了对虾血蓝蛋白变体的存在，为深入了解对虾血蓝蛋白免疫机制奠定了良好的基础。　　3、病原胁迫对3种HcL变体mRNA表达水平的影响　　RT-PCR分析发现3种HcL变体mRNA表达存在一定的组织特异性，其中HcLV2、HcLVt在本研究所涉及的10种对虾组织（肌肉、胃、后肠、心脏、肠、鳃、淋巴腺、肝脏、脑和血细胞）中均有表达；HcLV3在除胃组织以外的9种组织中显著表达；HcLV1在肌肉、胃、后肠和肝胰腺等4种组织中缺失表达。　　继而，选用副溶血弧菌，溶藻酸弧菌，河弧菌，大肠杆菌，乙型链球菌和金黄色葡萄球菌等6种病原菌胁迫凡纳滨对虾（分别将以上六种病原菌缩写为VP、VA、VF、EC、BS和SA），运用SQ-PCR分析显示，HcLV1对六种病原菌的胁迫表现出较明显的表达变化；HcLV2表达主要受VP、VF、BS和EC胁迫的影响；HcLV3表达变化主要与VP、VF和EC胁迫有关；HcLVt则在病原胁迫后变化不显著。　　最后，进一步采用Real-timePCR分析病原胁迫对HcLV1、HcLV2表达变化的影响。结果发现，HcLV1在上述六种病原菌胁迫对虾48、48、9、48、48和24h后出现较高的表达量，分别为对照组的9.5、6.2、11、8.5、8.8和1.9倍；HcLV2在除大肠杆菌之外的五种菌胁迫对虾9-48h后，与对照组相比，表达量上升3.1-22倍。由此说明，对虾血蓝蛋白大亚基变体与对虾免疫防御密切相关，且不同变体对不同病原菌存在响应程度的差异。　　4、1种HcL变体的原核表达及其免疫学功能研究　　在上述研究基础之上，进一步选取与病原胁迫免疫相关性最显著的HcLV1进行原核表达与免疫学活性分析，结果发现，HcLV1重组表达蛋白分子量为93.3kDa，与预期大小一致，其对副溶血弧菌等6种菌具有明显的凝集活性。rHcLV1对副溶血弧菌、溶藻酸弧菌和乙型链球菌的凝集活性最高，为rHcL的16倍，其次是对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的凝集活性，均为为rHcL的8倍，对河弧菌的凝集活性相对较低，仅为rHcL的4倍。说明，对虾血蓝蛋白变体确实具有明显的免疫学功能。　　综上所述，本研究主要发现凡纳滨对虾体内存在3种血蓝蛋白大亚基变体，其与对虾抵御不同病原微生物密切相关。所获研究结果，对丰富对虾血蓝蛋白的分子多态性研究，深入揭示血蓝蛋白功能多样性的分子机制，阐明对虾免疫防御机制等具有重要的意义。同时，为选育抗逆优良对虾品种、建立对虾病害的免疫学防治方法等提供了良好的科学依据，促进对虾养殖业的健康、持续发展。