研究背景慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease, CKD)已成为威胁全世界公共健康的主要疾病之一,严重危害人类健康及经济。流行病学调查数据显示,慢性肾脏病在中国、美国、日本、加拿大及伊朗的发病率已达到10%—13%,不亚于糖尿病和高血压的发病率。此外,CKD发病还呈现出年轻化趋势,二三十岁的透析患者越来越多,年龄最小的甚至不到10岁,令人震惊。因此,延缓肾脏疾病并减少肾脏损伤已刻不容缓。肾脏纤维化是各种进展性肾病的最终通路。尽管肾脏纤维化的发病机制复杂,但大量研究证实TGF-β在肾脏纤维化中发挥着关键性的作用,与细胞的增殖、凋亡、活化、迁移、细胞外基质合成有密切关系,参与肾纤维化的各个环节中,TGF-β被认为是最重要最强烈的纤维化诱导因子。TGF-β1诱导的生物学功能主要依赖其完整的Smads信号通路。TGF-β1首先与其Ⅱ型受体(TβRⅡ)结合,TβRⅡ磷酸化Ⅰ型受体(TβRⅠ),激活的TβRⅠ将活化Smad蛋白Smad2和Smad3,磷酸化的Smad2和Smad3随后与Smad4一同进入细胞核,在核内调控了TGF-β1靶基因的转录。虽然大家都熟知这个过程,但是TGF-β1受体与Smad2和Smad3相互作用的机制还有待深入探索,研究发现在这过程中有多种衔接蛋白分子对其进行着调控从而促进TGF-β1-Smad信号。肾脏纤维化的病理特征是过量的细胞外基质(ECM)的积聚和沉积,而肌成纤维细胞(MFB)是导致病理条件下肾间质中ECM过度沉积的主要效应细胞。研究证实上皮一间充质转化((epithelial-mesenchymal transition, EMT)是MFB来源的一个重要机制。EMT,是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下失去其上皮表型向间充质细胞转分化的现象。已有越来越多的研究强有力地证实了EMT在不同类型的肾脏疾病中发挥着重要作用,而逆转EMT则能有效改善肾脏纤维化。虽然大量研究揭示了各种EMT的始动因素、调节因子及存在的信号通路,但是在所有的因素中,TGF-β1是核心因子,启动并调节EMT的全过程。我们的课题合作研究组发现Kindlin-2蛋白可以诱导乳腺癌细胞EMT而促进乳腺肿瘤细胞的转移。这个发现引起了我们对Kindlin-2分子的关注,Kindlin-2是否也参与肾脏上皮细胞的EMT而促进肾脏纤维化呢?Kindlin-2是Kindlin蛋白家族的一种,Kindlin蛋白家族是一类新型的衔接蛋白,它能与整合素相互作用加强整合素的激活。研究还发现Kindlin-2在肌动蛋白极化、细胞伸展及整合素连接激酶定位在黏着斑中发挥着必不可少的作用。另外,Kindlin-2在胚胎发育及肿瘤进展中发挥着重要功能。目前,有关Kindlin-2在肾脏中的作用鲜有报道。唯一的一篇也是最新的一篇文献指出Kindlin-2通过与整合素的相互作用调节足细胞的粘附和纤维连接蛋白的沉积,文中还提出TGF-β能明显增加足细胞Kindlin-2的表达,提示Kindlin-2可能参与肾脏疾病。我们分别以人近端肾小管上皮细胞为体外模型,以小鼠单侧输尿管结扎模型开展动物实验并结合患有肾脏纤维化的临床病人的肾脏活检标本研究Kindlin-2在肾脏纤维化中的作用,并探讨了Kindlin-2与TGF-β-Smad3信号通路的关系,阐明了具有创新性的分子机制。第一章Kindlin-2参与TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞的上皮-间充质转化(EMT)目的观察Kindlin-2对HKC细胞上皮-间充质转化的作用；研究TGF-β1对Kindlin-2的调节作用并探索Kindlin-2在TGF-β1诱导HKC细胞EMT中充当的角色。方法1.常规培养肾小管上皮细胞HKC,不同剂量的TGF-β1(0、1、2、5及10ng/ml)作用于HKC细胞48小时或5ng/ml TGF-β1作用于HKC细胞不同时间(0、12、24、48及72小时),或5 ng/ml TGF-β1处理HKC细胞不同时间(0、12、24及48小时),Western blot及Real-Time PCR检测E-cadherin、α-SMA及FN蛋白和mRNA的表达。2.在HKC细胞中瞬时转染全长Kindlin-2质粒和对照Flag载体48小时,Western blot及Real-Time PCR检测E-cadherin、α-SMA及FN蛋白和mRNA的表达。3.建立稳定表达Kindlin-2和对照空载Flag的HKC细胞系,Western blot> Real-Time PCR及免疫荧光检测两组细胞E-cadherin、α-SMA及FN的蛋白和mRNA表达。4. Kindlin-2 siRNA或Control siRNA作用HKC细胞24小时后,再用TGF-β1处理细胞48小时,Western blot及Real-Time PCR检测E-cadherin、α-SMA及FN的蛋白和mRNA的表达。结果1. TGF-β1以时间依赖的方式上调HKCα-SMA蛋白(F=4.546,P=0.039)及mRNA表达(F=18.537,P=0.001),增加FN蛋白(F=5.784,P=0.015)及mRNA表达(F=20.468,P=0.002),而下调E-cadherin蛋白(F=7.457,P=0.011)及mRNA表达(F=19.246,P=0.001)。2. TGF-β1以时间依赖的方式上调HKC细胞Kindlin-2蛋白(F=4.275,P=0.028)和mRNA (F=16.909,P=0.000)的表达,同时,TGF-β1以剂量依赖的方式诱导HKC细胞Kindlin-2蛋白(F=4.732,P=0.021)和mRNA(F=5.843, P=0.021)的表达。3.短暂过表达Kindlin-2 48小时后,与Flag组相比,转染Flag-Kindlin2的HKC细胞中α-SMA蛋白(t=-2.905,P=0.044)及mRNA表达显著上调(t=-4.069,P=0.015),同样FN的表达明显增加。而E-cadherin蛋白(t=3.135,P=0.035)及mRNA (t=4.546, P=0.010)表达显著下调。4.稳定表达Kindlin-2后,HKC的形态学发生改变,从原来的鹅卵石状变成长梭形。稳定表达Kindlin-2后,HKC细胞中α-SMA和FN蛋白及mRNA表达显著上调,E-cadherin蛋白和mRNA表达显著下调。5. Kindlin-2 siRNA作用于HKC细胞后抑制TGF-β1诱导的α-SMA蛋白(F=5.774,P=0.021)和mRNA (F= 16.663, P=0.001)表达,同样显著抑制FN蛋白(F=18.046,P=0.001)和mRNA(F=19.035, P=0.000)的表达。而Kindlin-2 siRNA能恢复被TGF-β1抑制的E-cadherin蛋白(F=12.054,P=0.002)和mRNA(F=7.218, P=0.012)的表达。结论1. TGF-β1以剂量和时间依赖的方式上调HKC细胞Kindlin-2的表达。2. Kindlin-2可以诱导HKC细胞的α-SMA和Fibronectin表达,抑制E-cadherin的表达,促进HKC细胞的EMT。3. TGF-β1诱导HKC细胞的EMT需要Kindlin-2的参与。第二章Kindlin-2参与TGF-β1信号通路的机制研究目的研究Kindlin-2与Smad3及TGF-β1受体的关系,探索Kindlin-2在TGF-β1-Smad3信号通路中发挥的作用。方法1.常规培养HKC细胞,实验分组为：转染空载Flag组、转染Flag-Kindlin-2组、转染空载Flag或Kindlin-2 48小时后加TGF-β1处理30分钟组,分别提取细胞总蛋白,Western blot检测Smad3的磷酸化。2.实验分组为：转染Control siRNA72小时组、转染Kindlin-2 siRNA72小时组、转染control siRNA或Kindlin-2 siRNA72小时后加TGF-β1处理30分钟组,分别提取细胞总蛋白和核蛋白,Western blot检测Smad3的磷酸化。3.实验分组为：共转染Control siRNA及Flag空载72小时组、共转染Control siRNA及Flag空载72小时后加TGF-β1处理30分钟组、共转染Kindlin-2 siRNA及Flag空载72小时后加TGF-β1处理30分钟组和共转染Kindlin-2 siRNA及抵抗Kindlin-2 siRNA的质粒72小时后TGF-β1处理30分钟组,提取细胞总蛋白,Western blot检测Smad3的磷酸化。4.转染Flag-Kindlin-2至HKC细胞中,免疫共沉淀检测Kindlin-2与Smad3的相互作用。5.转染Flag-Kindlin-2-N端或C端至HKC细胞中,GST-pull down检测Kindlin-2与Smad3相互作用的区域定位。6.共转染Flag-Kindlin-2及HA-TβRⅠ或Flag-Kindlin-2及HA-TβRⅡ至HKC细胞中,免疫共沉淀检测Kindlin-2与TβRⅠ和TβRⅡ的相互作用。7.共聚焦荧光显微镜观察Kindlin-2与Smad3、TβRⅠ和TβRⅡ的共定位。8.免疫共沉淀检测敲低Kindlin-2后对Smad3与TβRⅠ的结合的影响。结果1. Kindlin-2干预HKC细胞后,与对照组一样均不能引起Smad3的磷酸化。在分别转染Flag或Flag-Kindlin-2 48小时后再用TGF-β1作用30分钟后,与Flag组相比,Kindlin-2明显增加Smad3的磷酸化。2. Kindlin-2 siRNA处理HKC细胞72小时后再与TGF-β1作用30分钟,Kindlin-2 siRNA明显抑制TGF-β1诱导的Smad3的磷酸化及Smad3的核转移。而抵抗Kindlin-2siRNA的质粒有效恢复被Kindlin-2siRNA抑制的TGF-β1诱导的Smad3的激活。3.HKC细胞中转染Flag-Kindlin-2,免疫共沉淀结果显示Kindlin-2与Smad3有相互作用。GST-pull down结果显示,Smad3的MH1段与Kindlin-2的N端有较强的相互作用,未观察到Smad3的MH1段与Kindlin-2的C端的相互作用,Smad3的MH2段与Kindlin-2的N端及C端均没有相互作用。4.在HKC细胞中分别共转入Flag-Kindlin-2和HA-TβRⅠ或Flag-Kindlin-2和HA-TβRⅡ,免疫共沉淀结果显示,Kindlin-2和TβRⅠ及TβRⅡ均具有相互作用。5.HKC中转染Flag-Kindlin-2,免疫共沉淀结果显示Kindlin-2与Smad3及TGF-β1受体形成复合物。6.共聚焦荧光显微镜观察结果证明Kindlin-2与Smad3、TβRⅠ及TβRⅡ具有共定位。在正常状态下,定位区域主要分布在细胞膜上。在加入TGF-β1刺激后,Kindlin-2与Smad3在细胞核内具有共定位。7.免疫共沉淀结果显示Kindlin-2 siRNA抑制Smad3与TβRⅠ的结合,从而抑制TGF-β1诱导的Smad3的磷酸化。结论1. Kindlin-2不能激活Smad3,但是Kindlin-2与TGF-β1具有协同作用激活Smad3。2. TGF-β1引起Smad3的磷酸化需要Kindlin-2的参与。3. Kindlin-2分别与Smad3、TβRⅠ及TβRⅡ相互作用并形成复合物,在分布上发生共定位。4.敲低Kindlin-2后抑制Smad3与TGF-β1RⅠ的结合。第三章Kindlin-2在肾脏纤维化中发挥重要作用目的通过动物实验探讨Kindlin-2在肾脏纤维化中发挥的作用；检测患有慢性肾病的临床病人肾脏组织中Kindlin-2及p-Smad3的表达,探索Kindlin-2在慢性肾病中的作用并观察Kindlin-2及p-Smad3表达的相关性。方法1.ICR小鼠随机分为：注射Control siRNA假手术组(Control siRNA+Sham组),Control siRNA单侧输尿管结扎(UUO)模型组(Control siRNA+UUO组)及Kindlin-2 siRNA模型组(Kindlin-2 siRNA+UUO).采用单侧(左)输尿管结扎方法,建立梗阻性肾小管间质纤维化小鼠模型,Sham组只游离输尿管而不结扎,在术前一周和术后一周内通过尾静脉注射Control siRNA:或Kindlin-2 siRNA.术后7天处死动物,取出肾脏,分别用于免疫组织化学、Western blot和Real-Time PCR。2.运用HE及Masson染色观察肾脏组织形态学改变及胶原纤维的沉积,采用免疫组织化学法检测Kindlin-2、p-Smad3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及纤维连接蛋白(Fibronectin)表达的部位和变化。3. Western blot检测Kindlin-2、p-Smad3、Smad3、α-SMA及Fibronectin的蛋白表达。Real-Time PCR检测Kindlin-2、α-SMA及Fibronectin的mRNA表达。4.利用免疫组织化学方法检测病人标本中Kindlin-2及p-Smad3的表达。结果1.HE染色显示：与假手术组比较,UUO模型组小鼠肾组织出现不同程度的肾小管扩张或部分肾小管萎缩、间质面积增宽、间质炎症细胞浸润。而Kindlin-2 siRNA+UUO组,肾脏纤维化症状明显改善。2. Masson染色结果显示：与假手术组比较,UUO模型组小鼠肾组织胶原在肾小球及间质区显著增多。而在Kindlin-2 siRNA+UUO组,胶原沉积症状明显减少。3.免疫组化结果表明：Kindlin-2主要分布在肾小管细胞胞质中,细胞核中也有表达,p-Smad3只分布在细胞核中,a-SMA及Fibronectin只分布在小管间质中。与假手术组比较,UUO模型组小鼠肾组织Kindlin-2、p-Smad3、α-SMA及Fibronectin表达显著增加。而Kindlin-2 siRNA+UUO组,这些蛋白表达均明显减少。4. Western blot结果证明：与假手术组相比,UUO模型组小鼠肾组织Kindlin-2、p-Smad3、α-SMA及Fibronectin的蛋白表达显著增加,而Kindlin-2 siRNA+UUO组,Kindlin-2 (F=18.540, P=0.003)、p-Smad3 (F=14.735,P=0.005)、α-SMA(F=27.928,P=0.001)及Fibronectin (F=56.200, P=0.000)蛋白表达均明显减少。5. Real-Time PCR结果发现：与假手术组比较,UUO模型组小鼠肾组织Kindlin-2、α-SMA及Fibronectin mRNA表达显著增加,而Kindlin-2 siRNA+UUO组,Kindlin-2 (F=9.913, P=0.013)、α-SMA (F=8.175, P=0.019)及Fibronectin(F=80.396,P=0.000)mRNA表达均明显减少。6.病人标本免疫组织化学显示：与正常肾脏相比,患有肾脏纤维化的病人的肾组织中Kindlin-2及p-Smad3显著增加,并且两者具有正相关。结论1.在小鼠单侧输尿管结扎模型中,Kindlin-2、P-Smad3、α-SMA和Fibronectin及表达显著上调。2.敲低Kindlin-2有效减轻单侧输尿管结扎小鼠的肾脏纤维化。3. Kindlin-2在肾脏纤维化病人的活检组织中高表达,其增加与p-Smad3的表达具有正相关。