叶酸是一种水溶性B族维生素,不能由人体自身产生,只能从食物或药物中获取。叶酸主要参与一碳单位的转移,是细胞生长和组织修复必需的物质,对胚胎发育和生长至关重要。大量临床调查研究表明,妊娠前后补充叶酸能够降低神经管畸形的发生率和复发率。因此,1992年美国公共卫生服务中心等机构推荐育龄期妇女妊娠前后三个月每天服用400μg叶酸。从1998年开始,美国、加拿大等许多国家陆续在谷物和面粉中添加叶酸以强化叶酸的使用。我国从2009年开始免费向准备怀孕的农村妇女提供叶酸。流行病学调查结果显示,自从上述措施实施以来,神经管畸形的发生率减少了50%-70%。基于此,妊娠期间补充叶酸预防神经管畸形的发生已作为一项重大公共卫生措施长期贯彻实施。糖尿病合并妊娠(简称糖尿病妊娠)是指妊娠前已患有糖尿病或原有糖尿病未被发现,妊娠后进展为糖尿病。临床资料统计,糖尿病妊娠后代先天性畸形尤其是神经管畸形的发生率明显增加。研究发现,有效的血糖控制可明显减少神经管畸形的发生,提示由于医疗水平的改善,有更多外表健康的婴儿出生。然而,追踪研究发现,这些婴儿存在着不同程度的神经发育缺陷。因此,研究糖尿病妊娠孕妇娩出的外表正常子代的中枢神经系统发育情况以及采取何种有效预防措施具有十分重要的意义。临床调查和动物实验均表明,补充叶酸能够降低糖尿病妊娠时神经管畸形的发生。因此,一些专家建议糖尿病孕妇服用高剂量叶酸(4-5mg／d)以减少神经管畸形的发生。然而,糖尿病患者妊娠期间应用高剂量叶酸对胚胎中枢神经系统发育的影响目前尚不清楚。许多专家和学者主要从叶酸的吸收、基因的甲基化状态等角度探讨叶酸预防神经管畸形的机制。此外,有研究表明叶酸作为抗氧化剂可以减轻糖尿病妊娠引起的氧化应激状态,从而减少神经管畸形的发生。尽管如此,叶酸影响中枢神经系统发育的机制有待于进一步研究。中枢神经系统由神经管发育而来,而神经管主要由神经干细胞构成。妊娠期间,许多营养物质能够通过影响胚胎神经干细胞的增殖、凋亡和分化最终影响中枢神经系统的发育。叶酸影响神经发育的机制也可能是通过参与调节神经干细胞的增殖、凋亡、分化等过程实现的。然而,以往研究均来自于体外实验,叶酸对体内神经干细胞的影响及机制目前尚不完全清楚。本研究通过建立糖尿病妊娠小鼠模型,从神经干细胞增殖、凋亡、分化和神经元迁移角度,研究叶酸尤其是高剂量叶酸对外表正常胚胎中枢神经系统发育的影响,并探讨其作用机制。第一部分叶酸对孕鼠血糖水平和胚胎发育的影响我们首先建立糖尿病小鼠模型,根据小鼠血糖水平将实验组分为高血糖组(6.7mM<血糖水平<16.7mM)和糖尿病组(血糖水平≥16.7mM)。随后,将对照组、高血糖组和糖尿病组雌鼠分别与健康成年雄鼠合笼建立糖尿病妊娠小鼠模型,然后分别给予不同剂量叶酸(0、3mg/kg体重和15mg/kg体重),观察叶酸对孕鼠血糖水平、胚胎发育,尤其是胚胎中枢神经系统发育的影响。结果显示,高血糖组和糖尿病组孕鼠每个时间点的平均血糖水平均明显高于对照组,而添加两种剂量叶酸均对这两组孕鼠的血糖水平没有明显影响。叶酸能够改善高血糖组和糖尿病组孕鼠活体胚胎率,并且,补充叶酸尤其是高剂量叶酸后,两组孕鼠胚胎神经管畸形率明显降低。此外,叶酸还能改善糖尿病组孕鼠胚胎的体重和顶臀长。随后,我们对外观正常的各组胚胎端脑切片进行HE染色,结果显示,无论是否添加叶酸,各组胚胎端脑内部均没有明显的病理改变和结构异常。以上结果显示,叶酸对正常、高血糖和糖尿病妊娠母体血糖水平均无明显作用,但是能够明显改善高血糖和糖尿病状态下活体胚胎率和神经管畸形发生率,并且可以改善糖尿病引起的胚胎体重减轻和顶臀长缩短。然而,叶酸对母体正常、高血糖和糖尿病状态下外表正常胚胎端脑组织学结构没有明显影响。第二部分叶酸对胎鼠前脑神经上皮细胞增殖与凋亡的影响本实验中,我们采用BrdU掺入法检测叶酸对E11.5胚胎前脑神经上皮细胞增殖的影响。结果显示,对照组孕鼠接受叶酸干预后,其胚胎前脑BrdU阳性细胞比例明显升高；添加两种剂量叶酸后,高血糖组和糖尿病组胚胎前脑BrdU阳性细胞比例均明显增加。我们的研究结果表明叶酸能够促进正常、高血糖和糖尿病妊娠胚胎前脑神经上皮细胞的增殖。随后,我们采用TUNEL法检测叶酸对E11.5胚胎前脑神经上皮细胞凋亡的影响。结果显示,对照组孕鼠应用叶酸后,其胚胎前脑TUNEL阳性细胞比例没有明显变化；添加不同剂量叶酸后,高血糖组和糖尿病组胚胎前脑TUNEL阳性细胞比例均明显减少。以上结果表明叶酸能够减少高血糖和糖尿病妊娠胚胎前脑神经上皮细胞的凋亡。第三部分叶酸对胎鼠端脑神经干细胞分化的影响及机制本研究中我们检测了E13.5胚胎端脑早期神经元特异性标记物——神经元特异性Ⅲ型β-微管蛋白(neuronal specific class Ⅲ β-tubulin, Tuj1)的表达变化,探索母体应用叶酸对胚胎神经干细胞向神经元分化的影响。免疫荧光染色结果显不,Tuj1阳性细胞广泛分布在E13.5胚胎端脑脑室区以外的区域,对照组、高血糖组和糖尿病组孕鼠补充叶酸后胚胎端脑中Tuj1阳性细胞明显增多。Western blot和实时定量RT-PCR结果显示,叶酸可促进对照组、高血糖组和糖尿病组孕鼠胚胎端脑中Tuj1蛋白和mRNA的表达。以上结果表明叶酸能够促进正常、高血糖和糖尿病妊娠胚胎端脑神经干细胞向神经元分化。随后我们对叶酸引起神经干细胞向神经元过早分化的机制进行了研究,主要检测了与神经元分化相关的碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)转录因子的表达情况,如Neurog1、Neurog2、Mash1、NeuroD1和NeuroD2。结果显示,对照组孕鼠应用叶酸后,其胚胎端脑中Neurog1、Neurog2、Mash1和NeuroD2因子的mRNA水平明显升高。高血糖组孕鼠添加正常剂量叶酸后,其胚胎端脑中Neurog1和NeuroD2因子的mRNA水平升高,添加高剂量叶酸后Neurog1、Neurog2、Mash1和NeuroD2因子的mRNA水平明显升高。糖尿病组孕鼠应用正常剂量叶酸后,其胚胎端脑中Neurog1因子的mRNA水平升高,应用高剂量叶酸后Neurog1、Neurog2、Mash1和NeuroD2因子的mRNA水平明显升高。然而,NeuroD1因子mRNA表达在各组间均无明显变化。我们的研究结果提示神经分化相关bHLH因子可能参与叶酸引起的胚胎端脑神经干细胞向神经元的过早分化。另外,我们检测了E18.5胚胎端脑星形胶质细胞特异性标记物——胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表达变化,探索母体应用叶酸对胚胎神经干细胞向星形胶质细胞分化的影响。结果显示,GFAP阳性细胞主要位于端脑的脑室下区和海马区附近,以点状或线状的形态呈现,无明显突起。补充叶酸后,对照、高血糖组和糖尿病组孕鼠胚胎端脑中GFAP阳性细胞明显增多。Western blot和实时定量RT-PCR结果显示,叶酸可引起对照组、高血糖组和糖尿病组孕鼠胚胎端脑中GFAP蛋白和mRNA水平升高。以上研究结果表明叶酸能够促进正常、高血糖和糖尿病妊娠胚胎端脑神经干细胞向星形胶质细胞分化。本研究中我们主要检测了与星形胶质细胞分化相关bHLH转录因子的表达情况,如Hes1、Hes5、Idl和Id2,探寻叶酸引起神经干细胞向星形胶质细胞过早分化的机制。结果发现,应用叶酸后,对照组孕鼠胚胎端脑中Hes5、Id1和Id2因子的mRNA水平明显增加；两种剂量叶酸均可明显增加高血糖组孕鼠胚胎端脑中Hes5、Idl和Id2因子mRNA的表达；糖尿病组孕鼠应用正常剂量叶酸后,其胚胎端脑中Hes5和Idl因子的uRNA水平明显增加,应用高剂量叶酸可使Hes5、Idl和Id2因子mRNA水平明显升高。但是,Hes1因子的mRNA表达水平在各组间无明显变化。以上结果提示胶质分化相关bHLH因子可能参与叶酸引起的胚胎端脑神经干细胞向星形胶质细胞的过早分化。第四部分叶酸对胎鼠端脑神经元迁移的影响本研究中我们还检测了叶酸对E13.5胚胎端脑神经元迁移的影响。双皮层蛋白(doublecortin, DCX)是一种微管相关蛋白,主要在迁移神经元中表达。免疫荧光染色结果显示,补充叶酸后,对照组、高血糖组和糖尿病组孕鼠胚胎端脑中DCX阳性细胞明显增多。Western blot结果显示,对照组、高血糖组和糖尿病组孕鼠添加正常剂量叶酸后其胚胎端脑中DCX蛋白表达没有明显变化；高血糖组和糖尿病组孕鼠添加高剂量叶酸后,胚胎端脑中DCX蛋白水平明显升高。以上结果提示叶酸可能影响母体正常、高血糖和糖尿病状态下胚胎端脑神经元的迁移。总之,叶酸不仅能够促进对照组、高血糖组和糖尿病组胚胎前脑神经干细胞增殖,抑制高血糖组和糖尿病组胚胎前脑神经干细胞凋亡,还能促进对照组、高血糖组和糖尿病组胚胎端脑神经元的迁移,提示叶酸有助于胚胎中枢神经系统的发育。然而,叶酸尤其是高剂量叶酸,可能加重高血糖组和糖尿病组胚胎端脑神经干细胞的过早分化,干扰脑内环境,最终可能影响中枢神经系统的正常发育过程。本研究结果提示,高血糖和糖尿病妇女在妊娠前后服用叶酸时需谨慎,因为叶酸尤其是高剂量叶酸对神经系统发育的影响具有两面性。我们的研究为指导妊娠期间尤其是高血糖和糖尿病妊娠期间合理应用叶酸提供了实验依据。