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黄瓜是世界上重要蔬菜之一,我国是黄瓜第一生产大国。黄瓜在生产过程中常遭受病虫害的危害,其中霜霉病最为严重。前期研究表明,过敏性反应是黄瓜抗霜霉病的机制,黄瓜抗霜霉病相关基因(GD254261)在过敏性抗病反应中早期特异表达。因此,本研究的主要目的是克隆该基因、并对其基因功能进行初步研究,试图揭示其在黄瓜抗霜霉病机制中的调控作用,为深入开展黄瓜霜霉病抗性机理的研究奠定基础。研究结果如下:1.本实验根据已知的黄瓜EST片段(登录号:GD254261),分别利用基因组DNA和cDNA为模板扩增得到一个全长基因。测序比对分析发现,该基因长1288bp包含一个957bp的开放阅读框(ORF),编码318个氨基酸。该基因位于黄瓜的第3条染色体上,包含一个232bp的内含子。对该基因推导的氨基酸序列进行分析发现,该基因具有F-box结构域,并具有7个LRR重复基序,属于泛素E3连接酶基因F-box基因家族中FBXL的一类,并把该基因命名为CsFBXL(登陆为:KC493560)。该蛋白是一个亲水蛋白,系统发生树结果表明该蛋白与大豆F-box家族FBW2-like的亲缘关系最近。2. qRT-PCR分析结果表明:黄瓜抗病品种HNAU-0023离体叶片在接种霜霉病菌,在48h和72h后CsFBXL基因的表达量显著下调,而感病自交系112在诱导24h时显著上调表达。结果暗示,CsFBXL基因可能负调控黄瓜霜霉病过敏性抗病反应。CsFBXL基因的表达具有组织特异性,在根、茎、叶、花、果实各组织中表达各异,该基因在叶中表达量较高,根、茎中次之,花中表达量稍弱,而在果实中几乎不表达。在不同激素(ABA、SA、JA)诱导下,在前期表达量都较弱,在24h CsFBXL基因在ABA、SA诱导下显著表达,JA的表达量次于ABA、SA;因此推测黄瓜泛素CsFBXL基因可能参与ABA、SA、JA激素诱导的信号传导调控。黄瓜植株在4℃低温和42℃高温热激处理后,CsFBXL基因显著下调表达;CsFBXL基因在盐胁迫下,高浓度2.0%和5.0%的盐溶液能够促进该基因显著上调表达。结果表明,CsFBXL基因可能参与盐胁迫反应。3.将黄瓜CsFBXL基因ORF片段与原核表达载体pMAL-c2X进行连接,构建融合表达重组质粒,并转化至原核表达菌株BL21感受态细胞中,通过IPTG诱导融合表达。融合蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,诱导出了36.74kDa的重组蛋白,与预期大小一致。IPTG诱导2h后该蛋白开始表达,随后(3h和5h)蛋白的表达量逐渐增加,说明该蛋白具有活性。4.我们构建了CsFBXL::pHBT-GFP-NOS载体,利用原生质体瞬时表达技术,确定CsFBXL基因定位在细胞质中。