研究目的肥胖与糖尿病密切相关,两者的发病率均以惊人的速度增长,已成为当今世界的主要健康威胁。由于现有调节糖脂代谢的药物在疗效和安全性方面还不能满足临床需求,人们越来越重视从天然产物中寻找具有防治糖脂代谢异常的物质或寻找新的作用靶点来调节糖脂代谢,这对防治糖脂代谢异常相关疾病具有重要意义。天然黄酮类化合物具有广泛的生物活性,对人体安全性高。新橙皮苷是柑橘类果皮和白皮层中常见的黄酮类成分,本课题首次系统研究它的糖脂代谢调节作用及其作用机制,在明确药效的同时,力求找到其调节糖脂质代谢的关键信号分子。论文采用细胞和肥胖、糖尿病动物模型研究新橙皮苷对糖脂代谢的调节作用,并在细胞和动物水平上进一步阐明其作用机制,尤其是与FGF21和AMPK相关的分子机制。研究成果可为天然来源黄酮类活性成分防治糖脂代谢异常疾病研究提供思路和方法,可为FGF21和AMPK相关分子机制的进一步明确提供实验依据和线索,在慢性代谢性疾病防治理论和实践两方面均具有重要的指导意义。研究方法1.新橙皮苷对糖脂代谢的影响：1)采用葡萄糖检测试剂盒检测新橙皮苷对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响。2)采用油红O染色法观察新橙皮苷对FFAs诱导脂肪蓄积HepG2细胞脂滴含量的影响,采用甘油三酯和总胆固醇检测试剂盒检测新橙皮苷对FFAs诱导脂肪蓄积HepG2甘油三酯和总胆固醇含量的影响。3)C57小鼠喂饲高脂饲料,当高脂饲料组小鼠19周后出现稳定的糖脂代谢紊乱时开始实验,观察新橙皮苷对高脂饮食诱导肥胖(DIO)小鼠糖脂代谢的影响。主要观察给药2周后DIO小鼠糖耐量的变化和给药8周后DIO小鼠体重、饮食、腰围、体长、总脂肪含量、甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸、血糖、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A-I (apoA-I)、载脂蛋白B (apoB)含量及肝脏中脂滴含量的变化。4)新橙皮苷对db/db糖尿病小鼠糖脂代谢的影响,检测给药2周后血浆中葡萄糖、甘油三酯和总胆固醇的含量。5)新橙皮苷预给药8周后,链脲佐菌素(STZ)造模,继续给药3周,观察新橙皮苷对STZ诱导糖尿病小鼠血糖的影响。6)新橙皮苷预给药2周对蛋黄乳剂诱导急性脂质代谢紊乱小鼠脂质代谢的影响,检测血浆中甘油三酯、总胆固醇、LDL-C和HDL-C的含量。7)新橙皮苷给药2周对C57小鼠糖耐量及血糖的影响。8)新橙皮苷单次给药对C57小鼠淀粉耐量的影响。2.新橙皮苷调节糖脂代谢的可能作用机制：1)采用western blotting法检测新橙皮苷对p-AMPK蛋白表达的作用,并通过RT-PCR实验检测新橙皮苷对AMPK下游靶点hmg-coa、srebp1c、fas、cpt1等基因表达的影响。2)采用western blotting和RT-PCR法,观察新橙皮苷对PPAR-α和FGF21蛋白和基因表达的影响。3)采用体外酶反应法观察新橙皮苷对α-葡萄糖苷酶的作用。研究结果1.新橙皮苷体内外调节糖脂代谢的药效学研究：1)新橙皮苷浓度依赖地增加HepG2细胞的葡萄糖消耗,且增加细胞葡萄糖消耗的作用强于橙皮苷。2)新橙皮苷降低FFAs诱导脂肪蓄积HepG2细胞内的脂滴含量,且浓度依赖地降低该细胞内甘油三酯和胆固醇的含量。3)新橙皮苷调节高脂饮食诱导肥胖(DIO)小鼠的糖脂代谢,主要包括改善糖耐量,降低血糖,减轻体重,降低脂肪指数和食物效能利用率(FER),降低血浆、肝脏和肌肉中甘油三酯和胆固醇的含量,以及降低LDL-C/HLD-C和apoB/apoA-I的比值。4)新橙皮苷降低db/db糖尿病小鼠血浆中葡萄糖和甘油三酯的含量。5)新橙皮苷降低链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠的血糖水平。6)新橙皮苷调节蛋黄乳剂诱导急性脂质代谢紊乱小鼠的脂质代谢,包括降低血浆中甘油三酯、胆固醇和LDL-C的含量,升高HDL-C,新橙皮苷升高HDL-C的作用强于橙皮苷和柚皮苷。7)新橙皮苷改善C57小鼠的糖耐量,但不影响正常血糖。8)新橙皮苷改善C57小鼠的淀粉耐量。2.新橙皮苷调节糖脂代谢的作用机制研究：1)新橙皮苷对AMPK及其信号通路的影响：在HepG2细胞,新橙皮苷可增加p-AMPK蛋白表达；在FFAs诱导的脂肪蓄积HepG2细胞,新橙皮苷也具有上调p-AMPK蛋白表达的作用,且新橙皮苷可抑制AMPK下游脂质合成相关蛋白hmg-coa、srebplc和fas的基因表达,增加脂质分解相关蛋白cptl的基因表达；在DIO小鼠,新橙皮苷可增加肝脏p-AMPK蛋白表达,同时减少srebplc的基因表达,增加cptl的基因表达。2)新橙皮苷对PPAR-α和FGF21的影响：在FFAs诱导的脂肪蓄积HepG2细胞,新橙皮苷可增加PPAR-α和FGF21的蛋白和基因表达；在DIO小鼠,新橙皮苷可在蛋白和基因水平增加肝脏中PPAR-α的表达,并可增加肝脏中fgf21的基因表达,从而增加血浆中FGF21的含量。3)新橙皮苷具有α-葡萄糖苷酶抑制作用。结论新橙皮苷在体内外均具有调节糖脂代谢的作用,其作用机制可能与AMPK、 PPAR-α的激活和FGF21的表达分泌,以及α-葡萄糖苷酶的抑制作用有关。1.在体外,新橙皮苷可增加HepG2细胞葡萄糖消耗,降低FFAs诱导脂肪蓄积HepG2细胞内的脂质含量,其作用机制可能是激活AMPK,减少hmg-coa、 srebplc、fas的基因表达,增加cptl的基因表达,从而调节葡萄糖和脂质代谢,这些作用也可能与PPAR-a和FGF21的蛋白和基因表达上调有关。2.在高脂饮食诱导肥胖(DIO)小鼠,新橙皮苷可改善糖耐量,降低血糖,减轻体重,降低其脂肪指数和食物效能利用率(FER),降低血浆、肝脏和肌肉中的甘油三酯和胆固醇含量,以及LDL-C/HLD-C和apoB/apoA-I的值；其作用机制可能是增加肝脏p-AMPK蛋白表达,减少srebp1c的基因表达,增加cptl的基因表达,从而调节糖脂代谢；这些作用也可能与肝脏中PPAR-α和FGF21表达增加,从而增加血浆中FGF21的含量有关。3.新橙皮苷可降低db/db糖尿病小鼠血浆中葡萄糖和甘油三酯的含量,并可降低链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠的血糖水平。4.在蛋黄乳剂诱导急性脂质代谢紊乱小鼠,新橙皮苷可降低血浆中甘油三酯、胆固醇和LDL-C含量,升高HDL-C,其升高HDL-C的作用强于橙皮苷和柚皮苷。5.新橙皮苷可改善C57小鼠糖耐量,但不影响正常血糖。6.新橙皮苷可改善C57小鼠的淀粉耐量,其机制与α-葡萄糖苷酶抑制有关。