乌头霜霉病病原物检测方法研究

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乌头(Aconitum carmichaeli Debx)系毛茛科乌头属药用植物,为知名川产道地药材川乌、附子的原植物,在四川江油地区一直有大面积栽培。霜霉病是乌头栽培过程中容易大面积爆发且传播速度较快的一类叶部病害,对附子的产量和质量也有较大影响。乌头霜霉病是由霜霉科霜霉属真菌引起的病害,前期调查发现,其传播的途径可能为种苗携带和土壤传播,因其具有专性寄生的特点,在实验条件下很难离体培养,给该病原物的后续研究造成了困难。本研究利用石蜡切片和电镜扫描相结合的方法进一步研究其传播途径;建立SYBR Green I实时定量PCR检测体系,为实时监测土壤中病原菌数量并建立病情指数与病原菌数量之间的相关性提供依据,为土壤的安全性评价和病害预警打下基础;通过特异性引物研制对病原物快速检测的试剂盒。实验的研究结果如下:1.对患霜霉病的乌头的根、茎、叶进行石蜡切片,用两种方法对其进行染色,结果表明PAS染色法更适用于对组织中病原真菌的观察。光学显微镜和扫描电镜下都能在患病植株的根、茎、叶中发现病原菌的存在,病原菌在患病组织内部的传播路径为由根通过茎的导管传播至叶,最后通过叶背的气孔传出。2.建立的SYBR Green I实时定量PCR最优检测体系为总体积为25μL,SYBR Premix Ex Taq II 12.5μL,ddH2O 8.5μL,引物L2A、L2B各1μL,DNA模板1μL。最优条件为:95℃30s,一个循环;95℃5s,57℃30s,共40个循环;95℃10s,65℃5s,一个循环。建立的反应体系特异性强,灵敏度显示检测病原菌浓度下限为9.8×10-4ng/μL。标准曲线方程为y=-3.724x+32.393,相关系数(R2)为0.999,扩增效率为85.6%。稳定性良好,每个梯度的变异系数都小于2%。对接种土壤中病原菌孢子密度的检测下限为40个孢子/g土壤。接种土壤中病原菌孢子密度n与循环数(Ct)之间的关系式为:n=10(44.411-Ct)/5.3644。3.通过特异性引物L2A/L2B设计并研制了快速检测试剂盒,并按照2015版《中国药典》的要求对试剂盒进行检验。试剂盒对病原菌DNA最低检测浓度为5.6pg/μL,在4℃环境下保存1年内稳定有效,试剂盒特异性强,操作快捷简便,有很好的批内和批间重复性,能够用于实际检验。
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