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土壤的铜污染会给其中微生物造成一定的选择压力,根瘤菌要保证自身的存活并且与宿主植物形成有效的共生固氮体系,必须采取一定的保护机制来抵抗高铜浓度造成的胁迫。分离自陕西宁强代家坝铜锌矿中的辽宁慢生根瘤菌Bradyrhizobium liaoningense CCNWSX0360对铜的最大耐受浓度为2.0 mM。本文利用转座子Tn5-pRL1063a对B.liaoningense CCNWSX0360进行随机突变,建立了库容为17247的突变体库。铜敏感性筛选获得6株突变株Bln-d、Bln-163、Bln-c、Bln-29、Bln-32和Bln-54。采用质粒挽救法确定Tn5的插入位点,结果显示Bln-d和Bln-163中Tn5插入到同一个基因的不同位置,相似性比对鉴定为编码重金属转运P1B-type ATPase的基因,命名为cueA,其余4个突变体中Tn5分别插入到基因copA(编码多铜氧化酶)、ctpA(编码羧基末端处理酶)、tolC(编码TolC家族蛋白)和lptE(编码脂多糖转运分子伴侣)内部。重金属耐受性分析结果显示:Bln-d、Bln-163、Bln-c专一对铜敏感,说明cueA和cop A特异地介导菌株对铜的抗性,在保护细菌免受铜的毒害中起关键作用;除Cu以外,Bln-32、Bln-54和Bln-29不同程度地对其它重金属敏感,说明ctpA、tolC和lptE通过间接途径赋予根瘤菌铜抗性。根据上述基因的功能注释得出:在B.liaoningense CCNWSX0360中至少存在3种抗铜机制:跨膜转运机制(cueA和tolC)、氧化/还原机制(copA)和膜屏障保护机制(ctpA和lptE),共同赋予细菌抵抗铜胁迫的能力。根据跨膜金属结合基序及标签序列信息本研究将cueA编码的蛋白CueA归为Cu+/Ag+转运P1B-type ATPase。CueA的N端的金属结合基序为两段His-rich区,而不是典型的GXXCXXC基序。利用同源重组构建了突变体ΔcsoR和ΔcueA,铜耐受性测试结果显示:ΔcueA和cueA::Tn5的铜敏感程度相同,对铜的最大耐受浓度(MTC)为0.8mM,显著低于野生型;互补cueA基因能够回复突变体到野生型菌株的抗性水平。qRT-PCR和lacZ融合表达分析结果表明:Cu2+显著诱导cueA的表达且表达水平依赖于Cu2+的浓度;一价铜离子螯合剂BCS能够消除(减小)Cu2+对cueA的诱导和对细菌的毒害。结合铜耐受性测试、qRT-PCR以及lacZ融合表达分析结果证实了cueA通过向细胞周质空间转运一价Cu+来维持根瘤菌的铜抗性。运用qRT-PCR和lacZ融合表达分析技术检测了野生型、突变体ΔcsoR以及互补菌株ΔcsoR(csoR)中csoR和cueA的表达水平,结果表明:缺失csoR引起基因cueA和csoR高水平组成型表达;互补csoR恢复依赖Cu2+的诱导表达,证明了CsoR利用去阻遏机制负调节csoR和cueA。实验结果还表明:突变csoR显著增加了菌株对Cu、Zn和Cd的抗性,并且这3种金属离子均能诱导基因csoR和cueA的表达;在Escherichia coli GG48中表达CueA能够提高该菌对Zn和Cd抗性,说明cueA不仅能够介导Cu+而且介导Zn2+和Cd2+的抗性。此外,N端截短实验发现:缺失N端的His-rich区丧失CueA的部分铜抗性功能,完全丧失在CueA的Zn/Cd抗性功能,表明N端的His-rich区在CueA的抗铜功能中发挥重要作用但不是必须的,而在抗Zn和Cd的功能中是绝对需要的,具体作用还不清楚,可能通过金属离子结合位点来缓冲细胞内的金属离子浓度。通过共接菌实验比较野生菌和突变体?cueA的竞争结瘤能力,得出根瘤菌的铜抗性能够赋予其在铜胁迫下的结瘤能力。基因突变以及铜耐受性分析结果显示:cop操纵子中6个基因均专一对铜敏感,其中copA和copB是整个系统的核心组分,二者需要同时存在才能发挥作用;新基因2212和2213能够赋予cop操纵子的完全的铜抗性;copC和cus F则对菌株的耐受性贡献不大,推测这6个基因编码的蛋白可能相互作用形成介导铜抗性的符合体。这6个基因在不同铜浓度胁迫下具有相同的表达趋势,即在较低Cu2+浓度下,随着Cu2+浓度的升高各个基因的转录水平逐渐增加,在0.625 mM Cu2+浓度下表达量均达到最大,在高浓度下则转录水平下降。综合共转录验证实验及5’RACE实验得出这6个基因为一个转录单元,受同一个启动子启动转录,转录起始点为基因2213起始密码子上游第26个碱基“G”。启动子活性分析以及lacZ融合表达分析结果表明2213与2212之间的间隔序列在调节操纵子的表达起着关键作用,但具体调控机制还未研究不清楚。生物信息学分析数据显示:cop操纵子可能为一个进化上较为古老的铜抗性操纵子。与单独敲除cueA或copA相比,同时敲除这两个基因菌株更为敏感,说明cueA和cop操纵子两个独立的系统,共同保护细胞免受铜离子的毒害。