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人参皂苷Rg3(简称Rg3)为人参中药理活性较为突出的四环三萜皂苷。根据碳20上的羟基位置不同，Rg3分为两种旋光异构体，分别为20S-Rg3和20R-Rg3(简称G-Rg3)。G-Rg3已被开发为1类新药，用于提高临床原发性肺癌、肝癌的疗效及改善肿瘤患者的气虚症状、提高机体的免疫功能。本课题组先前的研究已经证明：G-Rg3能够拮抗对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)引起的急性肝损伤，且其可能通过激活PI3K/AKT信号级联保护肝细胞免于凋亡。然而，肝纤维化作为肝硬化的前期阶段，在给予适当的干预治疗可恢复至正常肝功能水平。由于临床治疗中的忽视，往往在其恶化为不可逆转的肝硬化或者肝癌才足够重视。是否G-Rg3能够逆转复杂的肝纤维化，目前尚不知晓。本研究基于自噬信号通路分别建立硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)诱导的亚急性肝损伤模型、慢性肝纤维化模型，同时联合体外LPS诱导的大鼠肝星状细胞系HSC-T6激活模型等两部分内容深入分析G-Rg3对肝纤维化的调控作用，旨在揭示G-Rg3潜在的逆转肝纤维化的分子机制。
1.G-Rg3对TAA诱导的亚急性(Subacute)肝损伤的保护作用
将小鼠随机分为4组，空白对照组(n=10)，TAA模型组(n=10)，G-Rg35mg/kg(n=10)，G-Rg310mg/kg(n=10)。除空白组外，每组小鼠均进行TAA腹腔注射，按150mg/kg，2次/周，为期4周。治疗组分别在第3周开始时每天给予不同剂量的G-Rg3，共持续2周。实验结果表明：TAA模型组组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平显著升高，同时TAA明显升高小鼠肝脏内氧化应激水平同时伴随大量的超氧化物歧化酶()(SOD)、谷胱甘肽(GSH)被消耗，过氧化氢酶(CAT)和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的堆积。组织病理学及H&E染色观察到模型组小鼠肝脏泛白、手触具有沙粒感，同时肝门静脉周围出现大量的炎性细胞浸润。经2周的G-Rg3治疗，上述症状得到明显改善。因此，我们分析G-Rg3能够拮抗TAA引起的亚急性性肝损伤可能通过改善初期受损的肝内氧化应激状态并减少炎性浸润，从而阻止肝脏进一步恶化。
2.G-Rg3对TAA致慢性肝纤维化的改善作用及自噬参与下的调控机制
基于体内TAA致亚急性肝损伤的实验结果分析，通过建立TAA诱导的慢性肝纤维化模型评估G-Rg3的抗肝纤维化作用并阐释其内在的调控机制。根据前期实验摸索，TAA首次注射剂量为100mg/kg，其余均为50mg/kg，每周两次。在为期10周的腹腔注射后，TAA显著破坏了小鼠肝功能状态，且受损的氧化应激状态显示MDA浓度升高，GSH水平降低。肝组织病理学检查显示模型组小鼠肝内紧密结构被破坏，肝脏多处静脉周围出现长纤维间隔，并伴有严重的炎性细胞浸润。利用Masson’s染色进一步评估胶原纤维的沉积状况，同样证实这一点。有趣的是，经过4周的治疗后，G-Rg3明显减少胶原纤维的沉积，暗示G-Rg3可以有效逆转肝纤维化进程。此外，利用ELISA分析、免疫荧光及westernblot等手段追踪并分析了促纤维化因子TGF-β1在肝脏中的分泌、分布情况，TAA能够引起TGF-β1在门静脉周围分泌增加，一定程度暗示肝纤维化的恶化。结合免疫荧光及westernblot手段分析肝星状细胞(HSCs)的激活情况，G-Rg3给药明显减少了α-SMA的阳性细胞表达，一定程度上抑制了HSCs的激活与增殖。最后，通过利用westernblot方法测定自噬相关蛋白在肝纤维化中的表达情况发现TAA能够引起小鼠肝脏内轻链蛋白LC3a向LC3b的转化，并伴随着自噬底物蛋白p62表达明显增多，表明自噬通路参与到TAA诱导的肝纤维化进程。然而，经治疗后小鼠肝纤维化得到明显改善，这可能很大程度上通过对自噬通路的调控实现。
3.G-Rg3对LPS诱导激活的肝星状细胞HSC-T6-自噬模型的干预
基于体内G-Rg3对TAA诱导的肝纤维化的保护作用的探讨，为进一步厘清自噬在肝纤维化中作用以及G-Rg3对自噬通路的调控，利用炎症诱导剂脂多糖(LPS)建立自噬的细胞模型。结果表明；G-Rg3在2μM以上能够对HSC-T6细胞产生明显的抑制作用，且该剂量范围对人正常肝细胞L02无细胞毒性。利用westernblot手段以自噬通量LC3b/a，p62为指标确定LPS在100ng/mL，孵育24h可引起HSC-T6细胞明显的形态变异。同时，不同剂量的LPS促进了HSC-T6细胞中α-SMA的分泌暗示HSCs的激活与增殖。进一步的实验表明：G-Rg3能够降低LPS引起的自噬通量的增加，部分证实了G-Rg3能够抑制在HSC-T6细胞激活中参与的自噬过程。同时利用抑制剂Rapamycin验证自噬激活对HSC-T6细胞的影响，Rapamycin在100和200nM剂量下明显增加p62的表达，而给药G-Rg3后能够部分缓解该抑制作用。此外，利用PI3K抑制剂LY294002明显抑制了自噬相关蛋白的表达。结合体内对PI3K/AKT级联信号的考察，G-Rg3可能通过部分激活该级联信号，并主要通过抑制自噬潮的发生减少HSC-T6细胞的激活与增殖，逆转肝纤维化的发生。
综上所述，本研究结果揭示G-Rg3能够通过减轻TAA引起的氧化应激损伤、抑制炎症反应进而改善TAA诱导的亚急性肝损伤，实现肝纤维化的逆转，并且这可能通过调节PI3K/AKT信号通路及其介导的自噬信号通路。本研究能够为临床上治疗肝纤维化、肝硬化及其相关保健药物的开发提供理论依据。
1.G-Rg3对TAA诱导的亚急性(Subacute)肝损伤的保护作用
将小鼠随机分为4组，空白对照组(n=10)，TAA模型组(n=10)，G-Rg35mg/kg(n=10)，G-Rg310mg/kg(n=10)。除空白组外，每组小鼠均进行TAA腹腔注射，按150mg/kg，2次/周，为期4周。治疗组分别在第3周开始时每天给予不同剂量的G-Rg3，共持续2周。实验结果表明：TAA模型组组小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平显著升高，同时TAA明显升高小鼠肝脏内氧化应激水平同时伴随大量的超氧化物歧化酶()(SOD)、谷胱甘肽(GSH)被消耗，过氧化氢酶(CAT)和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的堆积。组织病理学及H&E染色观察到模型组小鼠肝脏泛白、手触具有沙粒感，同时肝门静脉周围出现大量的炎性细胞浸润。经2周的G-Rg3治疗，上述症状得到明显改善。因此，我们分析G-Rg3能够拮抗TAA引起的亚急性性肝损伤可能通过改善初期受损的肝内氧化应激状态并减少炎性浸润，从而阻止肝脏进一步恶化。
2.G-Rg3对TAA致慢性肝纤维化的改善作用及自噬参与下的调控机制
基于体内TAA致亚急性肝损伤的实验结果分析，通过建立TAA诱导的慢性肝纤维化模型评估G-Rg3的抗肝纤维化作用并阐释其内在的调控机制。根据前期实验摸索，TAA首次注射剂量为100mg/kg，其余均为50mg/kg，每周两次。在为期10周的腹腔注射后，TAA显著破坏了小鼠肝功能状态，且受损的氧化应激状态显示MDA浓度升高，GSH水平降低。肝组织病理学检查显示模型组小鼠肝内紧密结构被破坏，肝脏多处静脉周围出现长纤维间隔，并伴有严重的炎性细胞浸润。利用Masson’s染色进一步评估胶原纤维的沉积状况，同样证实这一点。有趣的是，经过4周的治疗后，G-Rg3明显减少胶原纤维的沉积，暗示G-Rg3可以有效逆转肝纤维化进程。此外，利用ELISA分析、免疫荧光及westernblot等手段追踪并分析了促纤维化因子TGF-β1在肝脏中的分泌、分布情况，TAA能够引起TGF-β1在门静脉周围分泌增加，一定程度暗示肝纤维化的恶化。结合免疫荧光及westernblot手段分析肝星状细胞(HSCs)的激活情况，G-Rg3给药明显减少了α-SMA的阳性细胞表达，一定程度上抑制了HSCs的激活与增殖。最后，通过利用westernblot方法测定自噬相关蛋白在肝纤维化中的表达情况发现TAA能够引起小鼠肝脏内轻链蛋白LC3a向LC3b的转化，并伴随着自噬底物蛋白p62表达明显增多，表明自噬通路参与到TAA诱导的肝纤维化进程。然而，经治疗后小鼠肝纤维化得到明显改善，这可能很大程度上通过对自噬通路的调控实现。
3.G-Rg3对LPS诱导激活的肝星状细胞HSC-T6-自噬模型的干预
基于体内G-Rg3对TAA诱导的肝纤维化的保护作用的探讨，为进一步厘清自噬在肝纤维化中作用以及G-Rg3对自噬通路的调控，利用炎症诱导剂脂多糖(LPS)建立自噬的细胞模型。结果表明；G-Rg3在2μM以上能够对HSC-T6细胞产生明显的抑制作用，且该剂量范围对人正常肝细胞L02无细胞毒性。利用westernblot手段以自噬通量LC3b/a，p62为指标确定LPS在100ng/mL，孵育24h可引起HSC-T6细胞明显的形态变异。同时，不同剂量的LPS促进了HSC-T6细胞中α-SMA的分泌暗示HSCs的激活与增殖。进一步的实验表明：G-Rg3能够降低LPS引起的自噬通量的增加，部分证实了G-Rg3能够抑制在HSC-T6细胞激活中参与的自噬过程。同时利用抑制剂Rapamycin验证自噬激活对HSC-T6细胞的影响，Rapamycin在100和200nM剂量下明显增加p62的表达，而给药G-Rg3后能够部分缓解该抑制作用。此外，利用PI3K抑制剂LY294002明显抑制了自噬相关蛋白的表达。结合体内对PI3K/AKT级联信号的考察，G-Rg3可能通过部分激活该级联信号，并主要通过抑制自噬潮的发生减少HSC-T6细胞的激活与增殖，逆转肝纤维化的发生。
综上所述，本研究结果揭示G-Rg3能够通过减轻TAA引起的氧化应激损伤、抑制炎症反应进而改善TAA诱导的亚急性肝损伤，实现肝纤维化的逆转，并且这可能通过调节PI3K/AKT信号通路及其介导的自噬信号通路。本研究能够为临床上治疗肝纤维化、肝硬化及其相关保健药物的开发提供理论依据。