肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是一种肝细胞来源的原发性肝癌。世界范围内HCC每年发病率约为750000例,并且HCC在男性中位居全球第五位常见肿瘤,在女性中位居第七位常见肿瘤。乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC发生发展的主要危险因素。乙肝病毒的进化动态学的特点是高突变率(>10-5核苷酸替换/位点/年),主要是由于乙肝病毒的易于出错的逆转录酶(reverse transcriptase, RT)和其快速的复制率(>1011颗粒/天)。文献报告这些大量发生的乙肝病毒突变可能会产生重要的生物学影响,并且研究已发现其与肝细胞癌的发生发展密切相关。乙肝病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)是HBV基因组的一种高度稳定的存在形式。其主要作为病毒mRNA和pgRNA的转录模板,也是病毒感染和复制的重要标志,被公认为HBV持续感染和肝脏进行性病理改变的根本原因。乙肝病毒的cccDNA和HBV基因变异一直是相关领域的研究热点,而乙肝病毒cccDNA和HBV基因变异的关系及其对肝癌的风险尚不清楚。第一部分：HBsAg阴性肝细胞癌患者肝内HBV DNAs水平研究本研究旨在探讨中国HBsAg和HBeAg均阴性的原发性肝癌患者中乙肝病毒在肝细胞内(癌与癌旁)的状态和水平,以及HBsAg、HBeAg均阴性的原发性肝癌患者中的隐匿性乙肝感染(OBI)的临床特征和OBI对预后的影响。我们采用实时荧光定量TaqMan PCR方法,定量检测11对(HBsAg阴性)和57对(HBsAg阳性)肿瘤组织(TT)和癌旁组织(ANTT)的乙肝病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)和总DNA(tDNA)。这68例HBeAg阴性的HCC患者HCV抗体阴性、术前没有接受过抗病毒治疗。结果显示11例HBsAg(-)患者中,36%的患者HBsAb(+) HBeAb(+) HBcAb(+)。然而,只有9%的表面抗原阴性的患者是HBsAb(-) HBeAb(+) HBcAb(+),而这种类型在表面抗原(+)组占绝大多数(93%)。11例HBsAg(-)和HBeAg(-)HCC患者的TT和ANTT HBV tDNAs都可检测。HBsAg(-)组的乙肝病毒cccDNA和tDNA低于HBsAg(+)组。OBI的患者有较低的肝硬化的风险。结论：肝内HBV DNAs,例如HBV cccDNA和tDNA对HCC的隐匿性乙肝感染诊断和随访监测中具有重要的意义,在未来转化医学中可辅助临床医师病因分析治疗、建立预防乙型肝炎病毒再激活的个体化治疗方案。第二部分：HBsAg阳性肝细胞癌患者肝内HBV DNAs水平与HBV突变的相关性研究本研究旨在探讨HBV肝内DNAs和病毒变异在HCC发生发展过程中的变化,我们进行了较大样本的纵向研究。首先探讨在肝癌患者(HBsAg阳性)的肝内(TT和ANTT)乙肝病毒变异和病毒水平之间的关系。其次探讨HBsAg阳性的HCC患者的临床特征和乙肝病毒变异对HCC患者术后预后的影响。我们对106例HBV相关HCC肿瘤组织和邻近的癌旁组织通过实时荧光PCR TaqMan探针法检测组织中HBVcccDNA和tDNAo采用PCR扩增后测序方法检测HBV全基因组的突变位点。用单变量和多变量回归法分析影响肝癌复发和生存的风险因素。研究发现患者乙肝病毒基因组pre-S1区A2962G/C2964A和pre-S2区C105T变异体有显著较高的肿瘤HBVcccDNA的水平,而BCP C1766T突变体有较低的肿瘤HBV cccDNA的水平。A2962G /C2964A突变与AFP水平较高有关。结论：本研究对揭示HBV相关原发性肝癌中乙肝病毒基因组特征,实现临床个性化病程监测和指导乙型肝炎病毒相关HCC患者的预后判断提供了重要的理论依据。第三部分：基于二代测序的HBV pre-S基因变异在HBV相关原发性肝癌中的临床意义研究本研究旨在一代测序的基础上,通过二代测序这一高灵敏度和高通量的新技术,针对具有重要功能意义的pre-S区段进行深度测序。对HBV pre-S基因变异和原发性肝癌二者之间的相关性进行探索,从而阐述HBV pre-S基因变异在原发性肝癌(HCC)发生发展中的作用及意义。研究发现在HCC和慢性乙肝患者(CHB)体内的HBV均是以B/C混合型为主；HCC患者的pre-S区域的HBV基因复杂度明显高于CHB患者；HBV cccDNA水平分别与HBV基因型A和B所占百分比(构成比)成负相关(r=-0.369,P= 0.001; r=-0.274, P= 0.012),而与C型构成比成正相关(r=0.338,P=0.002)。然而在HCC患者的癌旁组织中,HBV cccDNA水平与HBV基因型A,B和C型构成比均无明显相关性；在CHB组中,血清中HBV缺失片段主要集中在nt 2850-2863和nt 2-55。在HCC组中,癌与癌旁组织的HBV缺失片段主要集中在nt 2850-2863, nt 2889-2951, nt 3051-3078, nt 7-27和nt 40-54；血清中的HBV缺失片段主要集中在nt 2850-2864,nt 3152-3197和nt 40-52。文献报道pre-S突变蛋白可以激活依赖内质网应激信号途径和不依赖内质网应激信号途径,从而参与HCC的发生发展,具体机制有待深入研究。此外,HCC患者体内HBV pre-S区的片段缺失情况也明显高于CHB患者。我们将二代测序技术用于乙型肝炎病毒的序列,复杂度,基因型和缺失片段等方面的研究,可以改变既往一代测序技术在HBV病毒方面的局限性和不足,不仅有利于更加真实和准确地反映病毒在体内的状况,推进个性化辅助诊断,还将有利于临床指导随访、预后判断,在临床转化医学中有可能为未来的个体化治疗方案的制定提供帮助。综上所述,通过本课题的研究,我们发现HBV cccDNA, HBV突变与HCC的发生发展密切相关；肝内HBV DNAs作为乙肝感染的重要标志物在原发性肝细胞癌动态监测、疗效评价中具有潜在的应用前景；同时二代测序技术有望对临床个性化治疗和乙型肝炎病毒有关HCC患者的预后判断、实现精准医疗提供新的重要技术手段。