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人白介素-11(Interleukin-11,IL-11)在体内由PU-34细胞产生,具丝裂原活性、能支持IL-6依赖的浆细胞瘤细胞系T1165生长。最基本的功能在于造血调控作用,在体外对不同阶段的巨核细胞和血小板生成都具有特异的促进作用。体内注射hIL-11可显著刺激巨核细胞集落(CFU-MK)生长和增加血小板计数,还具有促进消化道上皮损伤恢复、调节脂肪细胞分化等多种生物活性。但是天然的白介素-11在在体内的半衰期较短,为了达到延长其在体内的半衰期,本研究采用了把白介素-11和人血清白蛋白以无连接肽的方式融合。取人胎肺成纤维细胞,以DMEM刺激培养,提取总RNA,通过反转录得到编码人白介素-11的cDNA,克隆到T载体pMD19-Simple上,构建含有IL-11编码基因的重组质粒pMD19/IL-11,DNA序列测定结果证明插入序列与IL-11编码序列完全一致。分别以pMD19/IL-11和含有编码HSA编码基因的重组质粒pBlue/HSA为模板,利用重叠PCR的办法,扩增得到HSA-IL-11融合基因,连接到载体上得到重组质粒pBlue/HI;对pBlue/HI和穿梭质粒pPIC9K分别用EcoRⅠ/NotⅠ进行双酶切,将HSA-IL-11融合基因克隆到表达质粒pPIC9K中构建重组表达质粒pPHI11;经测序验证,所得到的表达载体中目的片段碱基序列和预期一致,读框正确。将SalⅠ线性化的pPHI11电转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,通过组氨酸缺陷型标记和G418抗性筛选,得到抗0.75 mg/mL的G418的毕赤酵母转化子,经过PCR验证,转化子中含有HSA-IL-11融合基因。BMGY种子培养基培养细胞,经离心收集后,于BMMY诱导表达培养基在30℃,200 r/min条件下,以甲醇为唯一碳源诱导3 d,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,重组子表达出相应分子量的目标蛋白,HSA及IL-11抗体的Western-blot免疫杂交实验检测结果表明,融合蛋白中含有HSA和IL-11,说明HSA-IL-11融合蛋白得以表达。定量测定结果表明,融合蛋白在诱导上清液中的表达量约为120 mg/L。对重组菌在摇瓶转速、诱导甲醇浓度、诱导时间、诱导pH、诱导温度等条件下进行优化,得到的诱导条件为:诱导温度30℃,甲醇浓度5%,pH6,诱导细胞密度O.D.600=60,在上述优化条件下HSA-IL-11的表达量为198 mg/L。B9-11/MTT法检测诱导上清液生物学活性的结果表明,融合蛋白HSA-IL-11可以有效刺激B9-11细胞增殖,其IL-11生物学活性约为6.2×104 U/mg。