采用抗性砧木嫁接是黄瓜等果菜类蔬菜应对非生物胁迫抗性的有效措施。课题组前期发现南瓜砧木嫁接可以提高黄瓜耐盐性,根本原因是南瓜砧木限制了Na~+向地上部黄瓜接穗运输,但是相关分子机制尚不明晰。HKT1蛋白是一类Na~+转运蛋白,主要功能是限制Na~+向木质部装载,减少木质部Na~+含量。但是南瓜HKT基因在黄瓜嫁接苗中耐盐中的作用尚不明确。microRNA是一类广泛参与植物逆境胁迫的非编码RNA,在黄瓜嫁接苗耐盐过程中的响应及调控机制也不清楚。因此本研究从南瓜砧木对嫁接苗Na~+分配机制的影响、南瓜离子转运蛋白CmHKT1;1的功能解析、黄瓜嫁接苗microRNA对盐胁迫的响应及调控网络等三个方面开展,取得结果如下:1.耐盐南瓜砧木是限制Na~+向盐敏感黄瓜接穗运输的关键,砧木和接穗相互影响嫁接黄瓜幼苗Na~+的积累。通过构建南瓜和黄瓜正反嫁接组合,在75 mM NaCl下处理120 h,发现以耐盐南瓜为砧木的嫁接组合可有效限制Na~+在地上部的积累,缓解地上部盐害程度,而以盐敏感黄瓜为砧木的嫁接组合,无论是地上部是黄瓜还是南瓜,则都不能限制Na~+向地上部运输,表明耐盐南瓜砧木在嫁接黄瓜耐盐中的决定作用;另外当地上部接穗改变时,同样也会影响砧木根部的Na~+含量,表明嫁接苗在耐盐过程中砧木和接穗会相互影响Na~+的积累,存在砧穗互作。2.CmHKT1;1受盐胁迫诱导上调表达,集中在南瓜根部中柱部位,定位于细胞膜上。在耐盐南瓜砧木中克隆HKT基因,命名为CmHKT1;1。利用RT-PCR、qRT-PCR发现盐胁迫下南瓜CmHKT1;1主要在南瓜根部表达上调;亚细胞定位表明CmHKT1;1定位于细胞膜上,是一个膜蛋白;原位杂交技术显示CmHKT1;1表达主要集中在南瓜根部的中柱部位。3.CmHKT1;1是Na~+特异性转运蛋白。利用酵母突变体对CmHKT1;1的功能进行分析,在盐敏感的酵母菌株G19中异源表达CmHKT1;1可以提高G19的盐敏感性,说明CmHKT1;1具有Na~+转运功能;在K~+吸收缺陷型酵母WΔ6中异源表达CmHKT1;1,在K~+充足的条件下不能恢复K~+吸收能力,表明CmHKT1;1对K~+不具有转运能力;在离子耗竭曲线实验中,酵母转化CmHKT1;1造成Na~+含量下降,K~+含量不变,在同时含有Na~+和K~+的溶液中,K~+对Na~+含量下降也没有影响,表明CmHKT1;1没有Na~+/K~+协同转运功能。4.CmHKT1;1在南瓜砧木根部限制Na~+向木质部装载,减少了Na~+向地上部接穗运输,提高了黄瓜耐盐性。利用发根农杆菌介导CRISPR/Cas9技术对南瓜根部CmHKT1;1进行基因编辑,敲除南瓜根部的CmHKT1;1,降低了南瓜的耐盐性,显著提高地上部木质部汁液中Na~+含量,增加了Na~+在地上部叶片中的积累。在拟南芥HKT突变体hkt1中超表达CmHKT1;1,可以一定程度上恢复hkt1的耐盐性,利用Na~+特异性染料对根部Na~+进行染色,发现CmHKT1;1减少了Na~+向中柱的装载。在黄瓜中超表达CmHKT1;1,提高了黄瓜的耐盐性,增加了叶绿素含量、提高植株干重、减少了地上部Na~+含量。超表达CmHKT1;1的黄瓜作为砧木,野生型黄瓜作为接穗,发现同样可以提高嫁接苗耐盐性,可以提高叶绿素含量,降低叶片渗透液电导率,提高植株干重和降低地上部Na~+含量,证明CmHKT1;1在嫁接耐盐中的重要作用。5.利用高通量测序对盐胁迫下四种嫁接苗的根和叶片miRNA的表达进行全基因组鉴定。结果发现黄瓜已知的miRNA 323个,novel miRNA 119个,南瓜已知的miRNA 374个,novel miRNA 91个;南瓜、黄瓜的miRNA同源性较高,共有236个miRNA序列完全相同;对嫁接苗响应盐胁迫的miRNA进行鉴定,发现各嫁接组合中miRNA以下调为主,在黄瓜/南瓜嫁接组合根部则是以上调为主,67个miRNA上调,22个下调,利用韦恩图对各组织中响应盐胁迫的miRNA种类进行比较发现miRNA398在各组织均显著差异表达,说明miR398可能是一个耐盐基础响应miRNA;对差异表达的miRNA进行靶基因预测,发现大部分靶基因为转录因子,如MYB、NAC、HD-ZIP等;对黄瓜/南瓜嫁接苗中的差异表达miRNA靶基因进行GO分析和KEGG分析,发现靶基因多富集在代谢过程、催化活性、转录活性、刺激响应、植物激素信号转导等过程或路径;对黄瓜/南瓜嫁接苗接穗和砧木盐胁迫下的激素信号响应路径进行比较,发现miRNA参与了多种激素信号转导调控耐盐过程,如地上部黄瓜通过miR393调控TIR1参与生长素信号转导,地下部南瓜砧木通过miR159调控转录因子参与赤霉素信号转导。综上所述,本研究发现CmHKT1;1表达受盐胁迫诱导,定位于根部中柱内薄壁细胞的细胞膜上,作为Na~+特异转运蛋白,通过限制Na~+向木质部装载,减少了Na~+向地上部运输,进而减少地上部Na~+积累,增强了黄瓜接穗的耐盐性。鉴定了嫁接苗中相应盐胁迫的miRNA,并对盐响应的miRNA参与的生理生化过程及路径进行预测和分析。