溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因尚不十分清楚、以结肠黏膜连续性、弥漫性炎症改变为主要特点的慢性非特异性炎症性疾病。其主要临床症状为持续或反复发作的腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重等,病变主要侵犯远端结肠及直肠,并向近端结肠扩展,甚至累及整个结肠。近十余年来随着人们生活方式及饮食结构的改变,大量临床研究资料表明该病的发病率呈上升趋势。由于UC病因和发病机制尚不十分明确,病理生理机制复杂,临床上治愈率低,被WHO认定为最难诊治的疾病之一。近年来研究发现氧化应激(Oxidative Stress)与UC的发生有密切关系,氧化应激引起的氧自由基的过量表达及脂质过氧化在疾病的发生发展过程中起重要作用。另外研究发现免疫紊乱也是UC发生发展机制中的重要因素。Keap1/Nrf2/ARE路径是迄今研究发现的最重要的自身抗氧化应激反应通路之一,在全身多个系统疾病的发病机制方面均起重要作用,参与人体抗肿瘤、抗细胞凋亡、抗炎症反应、调节心脑血管反应、抗动脉粥样硬化等。Nrf2(NF-E2 related factor 2)属于CNC(cap’n’collar)转录因子家族成员之一,广泛存在于机体多个组织器官中,Kelch样环氧氯丙烷结合蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin associating protein 1,Keap 1)是Nrf2的重要受体,生理状态下,Nrf2位于细胞质中,与Keap l结合,处于被抑制状态,当受到氧化应激信号刺激后,Nrf2迅速与变构的Keap1解耦连,以稳定状态转位进入细胞核,与小Maf蛋白结合形成异二聚物,并与一顺式作用元件即抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合,结合ARE上的GCTGAGTCA位点,参与下游一系列Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的转录与调控。ARE是一个特异的DNA启动子结合序列,位于所调控的抗氧化酶基因和Ⅱ相解毒酶基因的5’端启动序列。1991年Rushmore等证实,ARE转录所必须的一段基因序列是TGACnnn GC。随后的研究又发现了一系列抗氧化应激基因,在它们的启动子区域有以上相同的一段序列,并且都可以结合转录因子Nrf2。越来越多的研究表明,ARE对包括Ⅱ相酶在内的许多抗氧化基因诱导和转录起到极其重要的作用。ARE驱动的靶基因包括谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthetase,γ-GCS),谷胱甘肽-s-转移酶(GST),苯鲲还原酶1(NQO1),UDP-葡萄糖苷酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGT),血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)等。这些蛋白的表白均能有效的阻止自由基的产生,从而起到抗氧化应激的作用。HO-1是抗氧化应激反应中极其重要的Ⅱ相解毒酶,HO是血红素分解代谢的起始酶和限速酶,可以将血红素分解产生为等摩尔量的胆绿素(biliverdin,BV)、游离铁(Fe2+)和一氧化碳(carbon monoxide,CO),在哺乳动物中胆绿素随之被胆绿素还原酶转化为胆红素(bilirubin,BR),Fe2+可以诱导体内铁蛋白的生成。HO有三个同工酶:HO-1、HO-2、HO-3。HO-1的表达可有效对抗机体氧化应激、炎症、缺血/再灌注损伤、细胞凋亡、移植排斥反应等病理状态,在多种疾病中均起到抗氧化应激的保护作用。多项研究发现,Nrf2与炎症性疾病关系密切,参与炎症的发生发展。在炎症性肠病尤其是溃疡性结肠炎的研究中已经发现Nrf2在UC患者的结肠黏膜组织中高表达,且Nrf2与UC的严重程度呈正相关。目前尚无对UC中ARE及HO-1的研究,我们将就UC患者中ARE的结合活性及HO-1的表达与UC患者病情的严重程度进行进一步研究。目的:检测UC患者结肠黏膜中ARE的结合活性及HO-1表达的变化,分析ARE、HO-1分别与UC病情严重程度的相关性。方法:本实验共收集临床确诊为溃疡性结肠炎活动期患者42例作为病例组,结肠息肉患者25例作为对照组,结肠镜下活检直-乙交界处结肠黏膜组织4块。按照Sutherland DAI评分标准对UC患者进行评分后进行分组(对照组25例=A组,轻中度组22例=B组、重度组20例=C组),采用凝胶电泳迁移率分析实验方法(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA法)检测结肠粘膜组织中ARE的结合活性,免疫组织化学方法检测结肠粘膜组织中HO-1的表达。结果:1依据Sutherland DAI评分、UC病情活动度Truelove和Witts分级,将UC患者分为轻度、中度、重度3组,3个组的评分均数依次为4.8±0.2分、8.6±0.7分、11.5±0.4分。入选患者的临床资料见Table1。2 HE染色结果:细胞核呈紫蓝色,细胞浆、基底膜及胶原纤维呈粉红色。正常对照组结肠黏膜上皮结构完整,可见少量炎性细胞浸润,腺体细胞排列整齐,杯状细胞较多;UC组黏膜可见大量炎性细胞如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等浸润,隐窝结构紊乱,隐窝内、隐窝上皮均可见炎性细胞浸润,黏膜上皮杯状细胞减少,偶可见潘氏细胞化生,重度者出现黏膜上皮缺失、脱落。3结肠黏膜组织中ARE结合活性的检测结果UC组结肠组织中ARE的结合活性均高于正常对照组,各组ARE结合活性程度依次为:重度活动组>轻中度活动组>对照组。任意两组间相比,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。4结肠粘膜组织中HO-1的检测结果结肠黏膜HO-1免疫组化显示HO-1在正常粘膜较少表达,主要位于细胞浆中,而UC组HO-1表达明显增多,细胞核、胞浆中均有表达;各组HO-1表达水平:重度活动组>轻中度活动组>对照组,任意两组间相比差异具有显著统计学意义(P<0.01)。5相关性分析UC患者中ARE结合活性的变化与HO-1表达的变化呈正相关,相关系数为0.946,P<0.01,具有显著统计学意义。结论:随着溃疡性结肠炎患者病情严重程度的进一步加强,结肠黏膜组织中ARE的结合活性不断增强,免疫组织化学方法检测HO-1的表达也不断增加,ARE与HO-1的关系呈正相关,ARE的结合活性及HO-1的表达强度在一定程度上可以反映UC的病情严重程度,UC的发病机制与Keap1/Nrf2/ARE/HO-1信号通路有关。