研究背景牙齿功能及寿命与牙周组织的支持密不可分,其中牙周膜（periodontal ligament,PDL）是围绕牙根并连结牙根和牙槽骨内壁的致密结缔组织。它具有一定的自我更新及修复的能力,但这种修复能力是有限的,在炎症等情况下该能力会受到抑制,针对牙周炎等情况所造成的牙周组织缺损最理想的治疗是获得一定程度上的牙周再生,其中种子细胞为牙周组织再生的研究重点。人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）被认为是牙周组织再生工程的关键细胞之一,具有多向分化以及自我更新潜能,是牙周组织再生最丰富、最直接的种子细胞,也是牙周缺损修复和基因治疗重要的细胞学基础。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt（核苷酸单位）的功能性RNA分子,不编码蛋白质,但可调控基因表达。lncRNA作用范围广泛,可在染色质水平、表达水平和翻译水平发挥调控作用,参与生命体的胚胎发育、组织分化和器官形成等生命活动。研究发现,lncRNA在多种复杂疾病的发生发展过程中可发生特异性表达,且在干细胞的干性维持及多向分化中也发挥着重要作用。然而,目前在hPDLSCs成骨分化过程中有关lncRNA的研究尚鲜有报道。本研究旨在探索lncRNA对hPDLSCs成骨分化的作用,为将来牙周组织缺损修复和牙周组织再生工程提供新的思路。本论文主要包括以下四章内容：第一章人牙周膜干细胞的分离培养与鉴定本章实验采用改良酶组织块法及有限稀释法分离纯化hPDLSCs,CCK8法检测并绘制细胞生长曲线,利用流式细胞仪检测细胞表面分子标记物,采用单克隆形成实验和多向诱导实验分别检测细胞的克隆形成能力及多向分化潜能。第二章基因芯片检测人牙周膜干细胞成骨分化相关lncRNA汲其验证采用基因芯片技术对成骨诱导14 d及对照组hPDLSCs的RNA提取物进行检测,分析成骨诱导前后hPDLSCs中mRN A及ncRN A的表达水平变化情况,利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）技术对基因芯片的检测结果进行验证。第三章人牙周膜干细胞成骨诱导前后lncRNA-mRNA虻共表达谱的构建及关键IncRNA的筛选利用基因本体论（gene ontology,GO）、路径分析（pathway analysis）等生物信息学方法对基因芯片结果进行初步的分析,采用编码.非编码.基因共表达（coding-noncoding gene co-expression,CNC）网络分析技术构建lncRNA与mRNA之间的调控网络图谱,根据分析结果筛选出在hPDLSCs成骨分化过程中的关键In cRNA;qRT-PC滥测关键lncRNA在hPDLSCs成骨诱导前后及牙周膜组织中的表达水平。第四章抑制TCONS₀0007046表达对人牙周膜干细胞成骨分化的影响构建lncRNA TCONS₀0007046 shRNA’陵病毒并进行细胞转染,利用qRT-PCR检测慢病毒抑制效率,CCK8法检测抑锘TCONS₀0007046表达对hPDLSCs增殖能力的影响。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性染色及茜素红S染色检测成骨诱导14 d后检测抑制T℃ONS 00007046表达对hPDLSCs成骨分化的影响,并利用qRT-PC法检测成骨相关基因（ALP.OCN.Runx2. BMP2及BMP6）表达水平变化。材料方法组织获取及细胞培养实验中所用离体牙取自南方医院口腔颌面外科门诊18～25岁患者因阻生需要拔除的健康、完整的第三磨牙（经患者知情同意）。所选患者无其他系统性疾病史、吸烟或特殊用药史。牙齿拔除后迅速置于含双抗的a-MEM培养液中,放入冰盒内送入实验室。在超净台内轻轻刮取牙根中1/3的牙周膜组织,PBS缓冲液中反复漂洗。用眼科剪将组织小心地剪碎成1mm×11 mm×1 mm大小,置于3mg/mL的Ⅰ型胶原酶和4 mg/mL的中性蛋白酶混合液中,37℃水浴消化30min。加入适量完全培养基终止消化,800 rpm离心3 min,小心弃去上清,并加入少量完全培养基,用枪头轻轻吹打均匀,使细胞悬液与松散组织呈混匀状态,接种至6孔板内铺平,加盖玻片于组织块之上并加入适量含有10%胎牛血清、100μmol/L磷酸盐抗坏血酸、2 mmol/L谷氨酸盐、100 U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的a-MEM培养液,于5%C02、37℃环境中培养,每2～3d换液。取第1代人牙周膜细胞,胰酶消化制成细胞悬液,并利用逐步稀释法将细胞浓度调整为10～15个/mL。按100 μL/孔的密度将细胞接种于96孔板中,5%C02、37℃环境培养12 h后,在倒置显微镜下进行观察,标记出仅含单个细胞的孔并加培养液至20 μL,每2～3d换液,当单细胞生长汇合至70～80%时消化传代。CCK8实验取第3代生长状态良好的hPDLSCs,以2×103个/孔的密度（约100μL/孔细胞悬液）接种于96孔板中,5% CO2、37℃培养箱中培养。细胞贴壁后,向每孔内加入10μL CCK8溶液,“十”字法混匀后避光培养1～4 h,然后用多功能酶标仪检测490 nm波长下各孔的OD值,并取平均值绘制生长曲线。流式细胞术检测细胞表面分子标记物取第3代处于对数生长期的hPDLSCs,以1×106个/mL的密度重悬于预冷的PBS缓冲液中。以小鼠抗人PE标记的C D146、CD2、CD31、CD34、CD90抗体及APC标记Stro-1抗体,冰上避光孵育1 h。预冷的PBS缓冲液清洗2～3次后,上流式细胞仪检测表面分子标记物。克隆形成率检测取第3代细胞,以1×102个/$1的密度接种于100 mm直径的培养皿中。置于5%C02、37℃环境培养箱内培养14d后,弃去原培养液,PBS缓冲液清洗后,用4%的多聚甲醛固定细胞,结晶紫染色剂染色,倒置显微镜下观察单克隆形成情况（以≥50个细胞为一个克隆）,并计算细胞克隆形成率。多向分化能力检测取第3代生长状态良好的细胞,以1×105个/孔的密度接种于6孔板中,待细胞生长至80%汇合时,弃去原培养液,并分别加入成骨、成脂诱导液,每3d换液。连续培养21d后,分别用2%茜素红S、油红O染色剂染色,显微镜下观察。RNA是取与基因芯片检测对第3代hPDLSCs进行成骨诱导,对照组常规培养,分别提取培养14 d后两组细胞的总RNA,Trizo1法提取细胞内总RNA。 NanoDropND-1000紫外分光光度计检测其浓度与纯度,分别进行lncRNA和mRNA表达谱基因microarray芯片检测,每组检测重复分别3次。实时荧光定量PCR检测提取细胞总RNA,检测其纯度和浓度,逆转录成cDNA后,SYBR Greei法进行PCR扩增,以GADPH作为内参基因,以2-ΔΔCt值代表基因的相对表达强度。生物信息学分析利用基因芯片结果,综合数据库资源,利用聚类分析、GO分析、pathway分析等生物信息学方法,对基因芯片的检测结果进行初步的分析,以P值大小作为显著性判断标准,P<0.05时认为数据具有统计学意义。编码-非编码基因共表达分析根据lncRNA和mRN A的差异表达谱,通过计算皮尔逊相关系数（Pearsonproduct-moment correlation coefficient,r）判断基因之间存在的相关性,并根据结果构建lncRNA与目标靶基因的基因共表达网络,使用Cytoscape软件绘制共表达网络图谱。慢病毒载体构建及细胞感染目的慢病毒载体为GV118-GFP,包装细胞为HEK293T细胞,由上海吉凯基因化学技术有限公司构建包装；阴性对照选择与人类基因无任何关联的靶点序列。将慢病毒以不同感染复数感染hPDLSCs,并于72 h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白荧光表达情况,以筛选确定最合适的感染复数。统计学分析采用SPSS19.0统计软件进行统计分析,数据以x±s表示,采用两独立样本t检验进行两组间比较,计算Pearson目关系数（r）以判断两个变量之间是否共同产生变化的关联程度,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.人牙周膜干细胞细胞生物学特性观察本实验采用改良酶组织块法及有限稀释法分离获得hPDLSCs,成骨及成脂诱导实验证明其有多向分化能力,克隆形成实验检测其具有克隆形成能力。流式检测结果显示,细胞阳性表达间充质干细胞表面分子标记物CD29（99.62%）, CD90（97.13%）,CD146（10.27%）和Stro-1（12.76%）;阴性表达造血干细胞分子标记物CD31（0.07%）和CD34（0.22%）.2.成骨诱导前后lncRNA及mRN差异表达情况基因芯片检测结果显示,hPDLSCs成骨诱导后共有994个lncRNA出现上调表达,1177个下调表达；共有3557个mRNA在成骨诱导后出现差异表达,其中1578个上调,1979个下调（变化倍数>2.0或<-2.0,P<0.05）。挑选lncRNA及mRNA进行qRT-PCR验证,其结果与芯片检测结果基本吻合。3.lncRNA-mRN譬共表达谱构建及关键lncRNA的挑选GO分析结果示,出现差异表达的mRNA与细胞生理过程、生物调节等多个过程存在显著相关性；Pathway分析示共有83条信号通路参与了hPDLSCs成骨分化过程,包括MAPK、VEGF、TGF-β等通路。挑选成骨相关mRNA（ALP、BMP6、 COL1A1、COL1A2、IL6、BMP5及BMP2）作为靶基因进行CNC分析并构建lncRNA-mRNA共表达图谱,显示共有131对1ncRNA及mRNA之间存在负相关,有262对正相关。对检测结果进行分析,挑选出TCONS₀0007046作为进一步研究对象,qRT-PCR对其表达进行验证显示该基因在PDL组织及hPDLSCs细胞内均存在表达,且成骨诱导后变化趋势与基因芯片结果具有一致性。4.抑制TCONS₀0007046表达对人牙周膜干细胞成骨分化、增殖的影响本实验成功构建TCONS₀0007046 shRNA慢病毒载体,并利用qRT-PCI凇测其抑制效率。CCK8法检测结果显示抑制TCONS₀0007046表达对hPDLSCs增殖不产生影响。ALP活性染色检测结果显示,对细胞进行14 d的成骨诱导后,TCONS₀0007046表达抑制的hPDLSCs细胞中的ALP活性较低。茜素红S染色结果亦显示,TCONS₀0007046表达抑制组细胞矿化结节形成量较对照组细胞少。qRT-PCR法检测结果显示,抑制TCONS₀0007046表达时,成骨相关mRNA ALP、OCN、Runx2、BMP2及BMP6的表达水平降低。结论（1）本实验利用有限稀释法分离培养出人牙周膜干细胞,具有在体外克隆形成及成骨、成脂向分化的能力。（2）在人牙周膜干细胞及其成骨分化过程中均存在大量IncRNA的显著差异表达。（3）生物信息学初步分析结果显示,lncRNA在人牙周膜干细胞成骨分化过程中发挥着调控作用,其可能与成骨相关基因的表达有关,且该调控过程可能有多条信号通路的参与。（4）lncRNA TCONS₀0007046对hPDLSCs的增殖不产生影响,抑制TCONS₀0007046表达时,hPDLSCs的成骨能力受到抑制,且该调控过程可能与成骨相关mRNA ALP、 OCN、Runx2、BMP2及BMP6的表达有关。