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目的:白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)是一种炎性细胞因子,主要由活化的树突状细胞、巨噬细胞、内皮细胞和T细胞分泌,在生物体抗感染免疫应答中起到重要的生理及病理作用。IL-23是由p19和p40两个亚基通过二硫键相连接形成的异源二聚体,只有当p19和p40共同表达才具有生物学功能。多种鱼类已鉴定出三种p40同源基因p40a/b/c(p40a、p40b、p40c),但它们是否都能与p19形成异源二聚体,目前还没有确凿的证据。众所周知,草鱼是中国“四大家鱼”之一,是我国重要的淡水养殖鱼类,但由于其易受各种病原菌和病毒的危害,引起炎症反应甚至发生聚集性死亡,导致养殖户经济损失严重。本研究旨在明确p40a/b/c与p19基因在正常草鱼组织中的表达差异、对细菌性感染的应答反应,以及它们之间形成异源二聚体的特征,预期为鱼类肠道炎症的病理机制研究奠定基础。方法:(1)通过NCBI获取草鱼p19及p40a/b/c的完整mRNA序列,设计相应qPCR引物,运用qPCR技术检测上述基因在健康草鱼以及使用嗜水气单胞菌腹腔刺激草鱼24 h后各组织中的转录水平;另采用腹腔注射和肛灌两种方式使草鱼感染嗜水气单胞菌,分别于1 d、3 d、7 d检测草鱼肠道组织中p19及p40a/b/c的相对表达量。(2)根据p19及p40a/b/c完整编码区序列,设计普通PCR引物获得各ORF序列,基于原核表达载体pET32a(+)及大肠杆菌原核表达系统重组表达p19及p40a/b/c融合蛋白(rgcp19、rgcp40a/b/c),以割胶纯化的rgcp40a/b/c为免疫原;另根据p19完整氨基酸序列设计短肽并与载体KLH交联成rgcp19-KLH,作为p19多克隆抗体的免疫原,制备抗草鱼rgcp40a/b/c及p 19多克隆抗体(rgcp40a/b/c pAb、rgcp19 pAb),通过琼脂糖免疫双扩散及ELISA实验检测多抗效价,Western blot验证其特异性。(3)利用制备的兔源rgcp19 pAb及鼠源rgcp40a/b/c pAb,通过Western blot 验证上述基因在草鱼肾组织细胞(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)的特异性表达,以及细菌脂多糖(LPS)刺激CIK后IL-23各亚基的表达变化。(4)利用制备的兔源rgcp19 pAb及鼠源rgcp40a/b/c pAb通过免疫共沉淀实验(Co-IP)分析p19与p40a/b/c在草鱼CIK细胞中的相互结合的特征,另构建p19及p40a/b/c的真核荧光表达系统,通过脂质体转染小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH-3T3)观察p19和p40的细胞共定位表达,明确p19及p40a/b/c形成IL-23异源二聚体的特征;使用LPS、poly(I:C)刺激NIH-3T3细胞,观察IL-23各异型体对抗感染的应答反应特性。结果:(1)p19及p40a/b/c在健康草鱼肌肉、肝脏、肠道、表皮、尾鳍、心脏、胸腺、脑、体肾、头肾、鳃和脾脏共12个组织及血液中均有表达。其中p19与p40c在鳃中表达量最高,其次为表皮和体肾;p40a在血液中表达量最高,其次是体肾、鳃;p40b在表皮中转录水平最高,其次是鳃、肠道、心脏、头肾。健康草鱼经注射嗜水气单胞菌感染24 h后,p19和p40的转录水平均发生变化。p19相对表达水平除了在心脏中基本没变化外,其余组织中都有不同程度的上调,其中头肾、血液、鳃和体肾上调幅度较大;p40a在鳃中上调幅度最大,其次是脾脏、胸腺和头肾,而在脑和体肾中基本没变化;p40b在头肾中上调幅度最大,其次是血液、表皮、胸腺,而在表皮和心脏中呈显著下调趋势;p40c在头肾、血液、鳃、肠道、脾脏、肝脏和体肾中的表达量显著上调,在表皮、心脏、尾鳍、肌肉、脑等多种组织中显著下调。腹腔注射嗜水气单胞菌至健康草鱼1 d、3d、7 d后在肠道组织中,p19及p40a/b/c的转录水平都是在第1 d显著上调,第3d上调幅度略下降,到第7 d显著下调且低于正常水平;肛灌方式下,p19的表达量在三个时间点都呈显著上调趋势,p40a与p40b的转录水平都是在第1 d显著上调,第3 d下调且显著低于草鱼肠道中的正常表达水平,第7 d又呈上调趋势,p40c在第1 d显著上调,第3 d和第7 d恢复至基础状态。(2)p19及p40a/b/c的ORF长依次为567、990、939、897 bp,原核诱导表达融合蛋白大小依次为37.67、54.28、52.71和50.71 kDa;琼脂糖免疫双扩散实验表明,p40a/c多克隆抗体效价为1:32,p40b多抗效价为1:64;采用ELISA法检测p19多克隆抗体的效价,结果为1:80000;Western blot结果显示,所制备的多克隆抗体可特异性识别草鱼p19与p40a/b/c原核表达蛋白。(3)在LPS刺激CIK细胞12 h时,p19和p40a蛋白表达量明显增加,24h时又下降至正常水平;而p40b和p40c蛋白则在LPS刺激24h时才上调表达,揭示p19和p40a在抗细菌性应答反应前期共同作用于上下游炎症信号通路,而p40b和p40c在后期发挥免疫功能。(4)以草鱼CIK为研究对象进行免疫共沉淀研究,结果表明p19与p40a/b/c均能相互作用形成异源二聚体IL-23a、IL-23b、IL-23c;NIH-3T3细胞定位结果显示,p19与p40a/b/c都是单独表达于细胞质中,共转染结果显示p19分别和p40a/b/c共定位于细胞质中,形成IL-23a、IL-23b、IL-23c,但蛋白表达形式不同,IL-23a与IL-23c呈颗粒状,在细胞质呈区域性分布,按颗粒大小与数量分析,IL-23a的表达量大于IL-23c;而IL-23b则均匀分布于整个细胞质。在抗细菌、病毒实验中,受LPS刺激后,转染IL-23a组的NIH-3T3细胞数量显著下降,IL-23a的阳性率变化不明显,推测在抗细菌免疫中IL-23a或受其影响的下游基因发挥细胞毒性作用;poly(I:C)刺激后IL-23a呈现明显的入核现象,NIH-3T3细胞数量及IL-23a 阳性率均明显下降,细胞毒性强,揭示IL-23a在抗病毒应答通路中发挥作用。IL-23b对LPS、poly(I:C)刺激的应答表现出显著差异,LPS刺激后,IL-23b 阳性率及NIH-3T3细胞数量明显下降,说明其对宿主细胞也产生毒性;但poly(I:C)刺激后NIH-3T3细胞数显著增加,IL-23b 阳性率却显著下降,推测IL-23b在抗病毒感染应答中对宿主起到保护作用。LPS刺激转染p19与p40c后的NIH-3T3细胞,IL-23c阳性率及NIH-3T3细胞数均增加,说明在抗菌过程中IL-23c具有抑制炎症、保护宿主的作用;而poly(I:C)刺激后,IL-23c阳性率显著增加,但NIH-3T3细胞数量显著下降,说明在抗病毒过程中,IL-23c或受其影响的下游基因产生细胞毒性。上述结果表明,p19与p40a/b/c均能形成异源二聚体,但它们在细胞中的表达方式不同,且在抗细菌与抗病毒感染中发挥不同的功能。结论:本研究构建了草鱼p19和p40a/b/c的表达模式图谱;成功构建了p19和p40a/b/c原核表达重组质粒以及真核荧光表达质粒;制备了 p40a/b/c鼠抗及p19兔抗,验证了 p19和p40a/b/c在体内都具有相互作用。IL-23a在抗细菌、病毒应答中具有明显的细胞毒性。IL-23b在抗细菌过程中也有一定的细胞毒性作用;但在病毒感染过程中对宿主具有一定的保护作用。IL-23c在细菌、病毒感染过程中表达量均提高,并在抗菌感染应答中具有保护宿主的功能,在抗病毒感染的应答中发挥细胞毒性作用。本研究结果为三种IL-23异型体(IL-23a、IL-23b、IL-23c)在免疫应答功能方面的深入研究提供思路,更是为鱼类肠道炎症的病理机制研究中奠定基础。