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肿瘤的发病率在不断升高，目前已成为人类最主要的死因之一。原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤，在我国发病率很高，目前尚无有效的治疗方法，基因治疗为原发性肝癌提供了一种新的治疗途径。缺少有效的治疗基因和对肿瘤的治疗缺乏特异性和靶向性仍是当前肿瘤基因治疗的重要的限制因素，对恶性肿瘤基因治疗的选择，应考虑它既能抑制恶性肿瘤的生长，但同时对正常分裂细胞无明显杀伤作用。AFP启动子为原发性肝癌特异性启动子，已被众多研究者成功应用于肝癌特异性基因治疗。vpr是人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1) 的非结构基因，编码-15kD的病毒蛋白，在HIV-1的生命周期中扮演着非常重要的角色，它可对宿主细胞生活周期进行一系列的调控，使细胞周期停滞在G2期(该期细胞化、放疗敏感)并可直接杀死细胞，因此，在恶性肿瘤的基因治疗中有很大的潜力，有望成为肿瘤基因治疗的有效手段之一。由于Vpr对多种细胞具有非特异性杀伤作用，如何使其特异性地杀伤肿瘤细胞是进一步开发利用vpr的关键。本研究首先用PCR的方法从pBSXCYPYVPR-xcTHY(简称Vpr质粒)中扩增出全长的HIV-1 vpr基因片段，克隆到pGEM-T载体，构建出克隆载体pGEM-T／vpr，酶切鉴定并对其进行序列分析后，切下vpr片段后插入到pCI质粒中polyA的上游，构建出中间载体pCIvpr，酶切鉴定正确后，再切下vpr-polyA插入质粒pAF5． 1中AFP启动子的下游，用PCR的方法鉴定插入方向正确后，并对其进行序列分析，构建成pAFvpr载体。在此基础上，我们利用在大肠杆菌细胞内进行腺病毒骨架与克隆有外源基因的穿梭载体同源重组的新策略，获得重组腺病毒rvAdAFvpr。这一过程包括三个依次递进的步骤：(1) 从pAFvpr载体切下表达盒：组织特异性启动子AFP-vpr-poly A，将其亚安徽医科大学硕士学位论文 克隆于腺病毒穿梭载体pshuttle，得到pshuttleAFVpr并进行酶切鉴定。 Q）重组穿梭载体 pshuttleAFvpr线性化，与腺病毒骨架载体 pAdEasyl在大肠杆菌细胞内进行同源重组得到重组腺病毒DNA质粒pAdE卿AFvpr。 u）将重组腺病毒质粒pAdEasyAFVpY线性化，转染293细胞得到重组腺病毒rvAdAFVpf。 获得重组腺病毒后，我们对其生物学特性进行了研究。首先，用透射电子显微镜观察了rvAdAFvpr的形态，发现其形态与典型腺病毒一致。然后，Hirt法快速提取腺病毒DNA，用Vpr特异性引物进行PCR反应，结果扩增出了目的片段。重组腺病毒具有遗传稳定性分析。 本研究成功制备了重组腺病毒vAdAFVpf，进一步将以之感染肝癌细胞，在肝癌细胞内AFP激活VPr的表达，VPr将发挥细胞致死和诱导GZM停滞作用而实现对AFP什）肝癌细胞的特异性杀伤作用，为肝癌基因治疗的研究打下了基础。