研究背景牙髓炎和牙周炎是口腔临床上最常见的疾病,牙髓炎症通常导致牙髓不可逆的坏死,严重者病情可扩展至根尖周炎,甚至无法保留患牙;而牙周炎症通常导致牙周支持组织的慢性进行性破坏,如不及时治疗同样可导致牙齿缺失及牙列缺损,妨碍口腔行使正常生理功能,同时严重影响颌面部健康和美观,严重损害患者的身心健康。牙髓组织和牙周组织的再生研究为牙髓及牙周疾病的治疗提供了一条全新的途径。口腔组织再生的核心理念在于通过种子细胞、支架材料、生长因子这三者的全部或部分联用或者单独使用,使功能已减弱或丧失的局部组织再生,恢复原有的生理功能。牙髓干细胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)和牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是目前受到较多关注的种子细胞。牙髓干细胞和成牙本质向分化和牙周膜干细胞的成骨分化对于牙髓组织和牙周膜组织的修复和再生至关重要,二者的联合使用成为构建人工牙根的可能途径之一。自发现DPSCs和PDLSCs十余年来,国内外学者在其定向分化的调控机制方面进行着不懈的探索,但有许多问题仍处于研究的起步阶段。本课题组首先报道了整合素α5(Integrin α5,ITGA5)对人DPSCs成牙本质向分化的重要调控作用:采用慢病毒载体抑制ITGA5在人DPSCs的表达后,DPSCs的增殖能力、迁移能力显著降低,体外矿化能力显著增强,而成牙本质相关基因如牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白 1(Dentine matrix acidic phosphoprotein 1,DMP1)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨连接素(Osteonectin,ON)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨涎蛋白(Bone sialoprotein,BSP)表达上调。这一初步研究的结果提示ITGA5对DPSCs的成牙本质向分化起负性调控作用。但ITGA5影响DPSCs成牙本质向分化的确切机制并不清楚。文献报道ITGA5对骨髓间充质基质细胞(Bone marrow mesenchymal stromal cells,BMMSCs)的成骨分化起重要作用:过表达ITGA5在体外实验中可促进BMMSCs的成骨分化,在体内实验中可促进骨缺损的修复。由此可见,ITGA5对DPSCs的成牙本质向分化和对BMMSCs的成骨分化起相反的调控作用,但其具体机制仍不清楚。ITGA5对PDLSCs的成骨分化作用尚未见报道。无论从来源还是分化特性,PDLSCs和DPSCs、BMMSCs都有异同之处,但ITGA5对PDLSCs起何种调控作用仍不清楚。DPSCs和PDLSCs二者都是牙源性间充质细胞,探索ITGA5对二者分化机制的差异非常有意义。明确ITGA5对这两种细胞分化过程调控的具体机制对于其临床应用十分必要。在本课题中,我们借助蛋白质组学的高通量检测手段,研究DPSCs和PDLSCs中ITGA5表达水平变化后其细胞蛋白质谱的改变,找出差异表达蛋白,结合生物信息学揭示其作用机制的差异。为将靶向调控ITGA5应用于DPSCs和PDLSCs的体外分化以及牙髓病和牙周病的临床治疗提供理论基础。第一章 人牙髓干细胞和人牙周膜干细胞的体外分离、培养和鉴定目的:体外分离培养人DPSCs和人PDLSCs并进行鉴定。方法:酶消化组织块法培养人牙髓细胞和人牙周膜细胞,分离而得的原代细胞随后通过有限稀释法进行分离纯化DPSCs和PDLSCs,克隆形成能力、流式细胞仪检测细胞表面标记物、多向分化(成骨、成软骨、成脂)能力检测鉴定所分离的DPSCs和PDLSCs。结果:采用酶消化组织块法可使大多数牙周膜及牙髓组织块、悬液中的单细胞顺利贴壁,连续培养5～10 d可见到部分组织块的边缘有细胞爬出,细胞呈纺锤形的成纤维细胞状,呈放射状或旋涡状围绕于组织块周围。倒置显微镜下可见细胞呈梭形,胞体丰满,透光性良好。有限稀释法分离培养DPSCs和PDLSCs,镜下观察细胞呈短梭型,胞体大小较均一,平板单克隆形成实验结果显示DPSCs和PDLSCs细胞克隆形成率均介于30%～40%之间。流式细胞仪检测DPSCs和PDLSCs表面分子标记物,结果显示DPSCs和PDLSCs表达间充质干细胞表面分子标记物CD29、CD90、CD73、CD44和CD105,几乎不表达造血细胞表面分子标记物 CD34、CD45、CD31 和人白细胞 DR 抗原(Human leukocyte antigen-antigen D related,HLA-DR)。DPSCs和PDLSCs成骨诱导培养可见大小不等的红褐色矿化结节形成、成脂诱导培养可见部分细胞胞浆内出现橙红色脂滴、成软骨诱导培养可见胞外有蓝色糖胺聚糖。结论:本实验所分离的两种细胞高表达间充质细胞表面标记物,低表达造血细胞表面标记物,证明了其间充质来源。结合取材来源,克隆形成能力和多向分化能力检测结果,可确定本实验所分离的细胞为DPSCs和PDLSCs。第二章 靶向调控整合素α5病毒载体的构建和整合素α5结合环肽的合成和检测目的:寻找可实现靶向调控人DPSCs和人PDLSCs中ITGA5表达水平的方法。方法:构建抑制表达ITGA5和过表达ITGA5的慢病毒载体,转染PDLSCs,qRT-PCR和Western blot验证其对PDLSCs中ITGA5表达水平的影响;通过基于 CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 endonuclease)技术的双载体系统构建ITGA5基因敲除DPSCs的细胞株,抽取全细胞DNA,错配酶法验证其对DPSCs中ITGA5的剪切效率;人工合成可特异性结合ITGA5的环肽GA-CRRETAWAC-GA,检测不同浓度环肽对DPSCs和PDLSCs中ITGA5表达水平的影响,qRT-PCR和Western blot、验证其对DPSCs和PDLSCs中ITGA5表达水平的影响。结果:抑制表达ITGA5和过表达ITGA5的慢病毒载体转染PDLSCs后可分别显著抑制和过表达PDLSCs中ITGA5的表达水平。基于CRISPR/Cas9技术的双载体系统构建三条针对ITGA5基因的sgRNA,分别转染DPSCs后错配酶法显示三条剪切序列均脱靶。DPSCs中ITGA5表达水平随着环肽浓度的增高,先下降,随后再增高,100 nM时对DPSCs中ITGA5的表达水平达到最高的抑制作用。而PDLSCs中ITGA5表达水平随着环肽浓度的增高而增高,100 nM时对PDLSCs中ITGA5的表达水平已达到较高的增强作用,随后增强作用的升高趋于不显著。结论:抑制表达ITGA5和过表达ITGA5的慢病毒载体可分别有效抑制和过表达PDLSCs中ITGA5的表达水平。基于CRISPR/Cas9技术的双载体系统构建ITGA5基因敲除DPSCs的细胞株未获成功。ITGA5结合环肽浓度为100 nM时是DPSCs和PDLSCs的最佳作用浓度。第三章 整合素α5对人牙髓干细胞和人牙周膜干细胞增殖和迁移的影响目的:探究ITGA5对人DPSCs和人PDLSCs增殖能力和迁移能力的影响。方法:取第三代对数生长期的DPSCs,设置对照组和ITGA5结合环肽组,CCK8细胞增殖实验和流式细胞术细胞周期实验检测ITGA5对DPSCs增殖能力的影响,Transwell小室迁移实验检测ITGA5对DPSCs迁移能力的影响;取第三代对数生长期的PDLSCs,设置对照组/ITGA5结合环肽组、ITGA5抑制表达病毒/对照病毒转染组、ITGA5过表达病毒/对照病毒转染组,CCK8细胞增殖实验和流式细胞术细胞周期实验检测ITGA5对PDLSCs增殖能力的影响,Transwell小室迁移实验检测ITGA5对PDLSCs迁移能力的影响。结果:DPSCs方面,使用ITGA5结合环肽GA-CRRETAWAC-GA处理DPSCs,CCK8增殖实验和细胞周期检测实验结果显示,和对照组相比,ITGA5结合环肽组细胞增殖能力显著降低,处于分裂间期的细胞数目明显减少。Transwell小室迁移实验结果显示,和对照组相比,ITGA5结合环肽组穿过小室隔膜的细胞数量明显降低。PDLSCs方面,CCK8增殖实验和细胞周期检测实验结果显示,和对照组相比,ITGA5抑制表达病毒组增殖能力受到明显抑制;而ITGA5过表达病毒组和ITGA5结合环肽组的增殖能力和对照组相比明显增强。Transwell迁移实验结果显示,和对照组相比,ITGA5抑制表达病毒组穿过小室隔膜的细胞数量明显减少,而ITGA5过表达病毒组和ITGA5结合环肽组穿过小室隔膜的细胞数量明显增多。结论:使用ITGA5结合环肽可显著抑制DPSCs的增殖能力和迁移能力。ITGA5抑制表达慢病毒能显著抑制PDLSCs的增殖能力和迁移能力,ITGA5过表达慢病毒和ITGA5结合环肽可显著增强PDLSCs的增殖能力和迁移能力。第四章 整合素α5对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响和机制目的:探究ITGA5对人DPSCs成牙本质向分化的影响和机制。方法:DPSCs设置对照组(CONT)、矿化诱导组(OM)、矿化诱导+ITGA5结合肽组(OM+SCP)、ITGA5 结合肽组(Synthetic cyclic peptide,SCP)、矿化诱导+ITGA5结合肽组+U0126组(OM+SCP+U0126)、矿化诱导+ITGA5结合肽组+LY294002组(OM+SCP+LY294002)。ALP活性染色和茜素红染色验证各组矿化情况,Western blot验证各组DSPP和黏着斑激酶(Focal adhension kinase,FAK)、蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)和细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinases,ERK)通路的蛋白表达情况;DPSCs转染慢病毒载体,设置ITGA5抑制表达组和对照组并进行矿化诱导,同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)蛋白质组学技术测序分析两组细胞样本之间蛋白谱表达及其差异情况,生物信息学分析筛选相关信号通路和可能作用机制,Western blot进行验证;DPSCs转染慢病毒载体,设置ITGA5抑制表达组和对照组,细胞复合羟基磷灰石/β-磷酸三钙(Hydroxyapatite/β-Tricalcium phosphate,HA/β-TCP)颗粒材料进行裸鼠背部皮下移植实验,8周后取材,苏木素-伊红(Hematoxylin&eosin,H&E)染色、瑞氏-吉姆萨染色、组织免疫化学染色观察两个组别成牙本质向分化情况。结果:和CONT组相比,DPSCs的OM组ALP活性染色明显加深,OM+SCP组染色较OM组显著加深,SCP组染色和CONT组类似呈淡染,OM+SCP+U0126组和OM+SCP+LY294002组的染色较OM+SCP显著降低,茜素红染色结果和ALP结果一致。Western blot结果显示,和OM组相比,OM+S CP组的ITGA5表达水平明显降低,而DSPP、pFAK、pAKT、pERK表达水平显著升高,ERK无明显改变。添加U0126或LY294002升高其ITGA5的表达水平,但降低DSPP、pFAK、pAKT、pERK的表达水平,ERK同样无明显改变。蛋白质组学检测从实验组和对照组总共六个样本中鉴定出13,339个肽段,3,898个ITGA抑制表达组和对照组的共表达蛋白。在总共67个显著差异表达蛋白中,和对照组相比,55个蛋白的表达水平在ITGA5抑制表达组中表达上调,12个表达下调。根据蛋白组学蛋白鉴定结果和基因本体论(GeneOntology,GO)富集、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes,KEGG)富集生物信息学分析,提示细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)及ECM-受体活性通路参与了 ITGA5介导的DPSCs成牙本质向分化。ECM的主要成分骨连接素(Osteonectin,ON/Secreted protein acidic and cysteine rich,SPARC)、光蛋白聚糖(Lumican,LUM)、玻连蛋白(Vitronectin,VTN)、Prolargin(PRELP)、核心蛋白聚糖(Decorin,DCN)、Ⅵ 型胶原蛋白 α1 链(Collagen type Ⅵ alpha 1 chain,COL6A1)、Ⅵ 型胶原蛋白 α2 链(Collagen type Ⅵ alpha 2 chain,COL6A2)、ⅪⅤ 型胶原蛋白 α1 链(Collagen type ⅪⅤ alpha 1 chain,COL14A1)和 Ⅴ 型胶原蛋白 α1 链(Collagen type Ⅴ alpha 1 chain,COL5A1)等关键蛋白分子在 ITGA5抑制表达组中均较对照组中表达水平升高。在OM+SCP组和OM组的验证中,Western blot结果和蛋白组学鉴定结果一致。HA/β-TCP和DPSCs裸鼠体内移植实验H&E染色和瑞氏-吉姆萨染色结果显示,和对照组相比,ITGA5抑制表达组中形成了较多的类骨质,细胞呈极性排列的不典型牙髓-牙本质复合体样结构也更为明显。免疫组织化学染色结果显示,ITGA5抑制表达组中的DSPP、Ⅵ型胶原蛋白α2链、骨连接素和玻连蛋白的表达水平均较对照组为高,其着色在环绕HA/β-TCP颗粒周围的位置最为明显。结论:ITGA5结合环肽GA-CRRETAWAC-GA在矿化诱导的条件下可促进DPSCs的成牙本质向分化。在矿化诱导的条件下,抑制DPSCs中的ITGA5表达不仅导致FAK、PI3K/AKT、MEK1/2/ERK1/2信号通路关键分子的磷酸化,还导致ECM的大量沉积及ECM-受体活性级联放大,进而促进DPSCs的成牙本质向分化。第五章 整合素α5对人牙周膜干细胞成骨分化的影响和机制目的:探究ITGA5对人PDLSCs成骨分化的影响和机制。方法:PDLSCs设置对照组(CONT)、矿化诱导组(OM)、矿化诱导+ITGA5i-LV转染组(OM+ITGA5i-LV)、矿化诱导+ITGA5-LV 转染组(OM+ITGA5-LV)、矿化诱导+ITGA5 结合肽组(OM+SCP)、ITGA5-LV 转染组(ITGA5-LV)、ITGA5结合肽组(SCP)、矿化诱导+ITGA5结合肽组+U0126组(OM+SCP+U0126)、矿化诱导+ITGA5结合肽组+LY294002组(OM+SCP+LY294002)。ALP活性染色和茜素红染色验证各组矿化情况,Western blot验证各组I型胶原蛋白α1链(Collagen type Ⅰ alpha 1 chain,COL1A1)、ITGA5、核心转录因子(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)、ON、和 FAK、AKT、ERK 通路的蛋白表达情况;PDLSCs转染慢病毒载体,设置ITGA5过表达组和对照组并进行矿化诱导,iTRAQ蛋白质组学技术测序分析两组细胞样本之间蛋白谱表达及其差异情况,生物信息学分析筛选相关信号通路和可能作用机制,Western blot和细胞免疫荧光进行验证;PDLSCs转染慢病毒载体,设置ITGA5过表达组和对照组,细胞复合HA/β-TCP颗粒材料进行裸鼠背部皮下移植实验,8周后取材,H&E染色、瑞氏-吉姆萨染色、组织免疫化学染色观察两个组别成骨分化情况。结果:和CONT组相比,PDLSCs的OM组ALP活性染色明显加深,OM+ITGA5i-LV组ALP活性染色较OM组显著减弱,OM+ITGA5-LV组染色较OM组显著增强,OM+SCP组ALP活性染色较OM组显著加深,ITGA5-LV组和SCP组的ALP活性染色和CONT组类似呈淡染,OM+SCP+U0126和OM+SCP+LY294002组的ALP活性染色较OM+SCP显著降低,茜素红染色结果和ALP结果一致。Western blot结果显示,和OM组相比,OM+SCP组的ITGA5、RUNX2、ON、pFAK、pAKT、pERK表达水平均显著升高,ERK无明显改变,添加 U0126 或 LY294002 降低其 RUNX2、ON、pFAK、pAKT、pERK 的表达水平,而ERK同样无明显改变。蛋白质组学检测从实验组和对照组总共六个样本中鉴定出22,451个肽段,3,868个ITGA5过表达组和对照组的共表达蛋白。在总共48个显著差异表达蛋白中,和对照组相比,37个蛋白的表达水平在ITGA5过表达组中表达上调,1 1个表达下调。根据蛋白组学蛋白质鉴定结果和GO富集、KEGG富集生物信息学分析,提示细胞骨架和细胞周期的改变参与了 ITGA5介导的PDLSCs成骨分化。II型细胞骨架角蛋白6B(Keratin,type II cytoskeletal 6B,KRT6B)、外周蛋白(Peripherin,PRPH)、肌间线蛋白(Desmin,DES)和I 型细胞骨架角蛋白 16(Keratin,type I cytoskeletal 16,KRT16)Western blot 结果和蛋白质组学鉴定结果一致:和OM组相比,KRT6B和KRT16在OM+SCP上调,而PRPH和DES在OM+SCP下调。KRT6B和DES的细胞免疫荧光结果同样和蛋白组学结果一致。HA/β-TCP和PDLSCs裸鼠体内移植实验H&E染色和瑞氏-吉姆萨染色结果显示,和对照组相比,ITGA5过表达组中形成了较多的类骨质和牙周膜样组织。免疫组织化学染色结果显示,ITGA5过表达组中的I型胶原蛋白(Collagen type I,COL1)和ON的表达水平均较对照组为高,其着色在环绕HA/β-TCP颗粒周围的位置最为明显。结论:ITGA5过表达慢病毒和ITGA5结合环肽GA-CRRETAWAC-GA在矿化诱导的条件下可促进PDLSCs的成骨分化,ITGA5抑制表达慢病毒则能抑制PDLSCs的成骨分化。在矿化诱导的条件下,激活PDLSCs中的ITGA5表达不仅导致FAK、PI3K/AKT、MEK1/2/ERK1/2信号通路关键分子的磷酸化,而且还导致细胞骨架和细胞周期的改变,进而促进PDLSCs的成骨分化。