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研究背景及目的原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,是癌症相关死亡的第二大病因[1]。据报道肝细胞癌的全球发病率正在上升,预计到2025年每年新发患者将超过100万人次[1]。手术切除目前仍是肝癌治疗的首选方式,但HCC患者总体的5年生存率低于15%。其主要是因为肝癌所表现出来的肿瘤异质性。血管生成是肿瘤发生和转移所必须的。研究发现,微血管密度与肿瘤生长、转移相关,与多种人类肿瘤的预后有显著相关性;肝癌是一种高度富血供肿瘤,血管生成在肝细胞癌的发生、发展、转移中发挥重要作用。团队前期研究证实肝前体细胞(Hepatic progenitor cells,HPCs)的活化与混合型肝癌术后的复发和生存显著相关,肝肿瘤的癌旁胆管反应(Ductular reaction,DR)的增殖状态(Proliferative index of Ductular reaction,PIDR)与癌旁肝前体细胞的活化具有显著的正相关性[2],提示癌旁的干性标志物的表达水平(包括Bmi1)可影响到肿瘤的异质性。基因Bmi1参与细胞的增殖与分化,调控细胞凋亡,与多种肿瘤的发生发展密切相关。本研究旨在分析明确:Bmi1的表达和肝前体细胞的活化水平、肝癌患者预后以及肿瘤血管生成水平是否相关;Bmi1的表达与肝前体细胞增殖分化是否相关;癌旁是如何影响到癌的,是否是通过血管生成相关机制发挥作用。研究方法第一部分回顾性收集了第二军医大学东方肝胆外科医院自1997年10月至2008年5月期间肝切除术后病理诊断为混合型肝细胞-胆管细胞癌的70例患者的临床预后及病理资料。手术病理蜡块均由我院病理科提供。使用抗人CD34、Bmi1、Ep CAM、CK7及PNCA抗体通过免疫组化评估患者术后病理切片癌灶的微血管密度(MVD)、癌旁及癌组织的Bmi1和Ep CAM表达水平、癌旁CK7-DR及PIDR的活化水平。使用单因素及多因素分析方法分析MVD(microvessel density)、Bmi1、Ep CAM、K7-DR以及PIDR表达水平对患者预后的影响。最后分析免疫组化标志物之间及各自与MVD的相关性。鉴于第一部分的研究结果,我们进一步于动物体内及细胞水平验证并探究Bmi1对肝前体细胞的活化及分化方向的具体影响,探索Bmi1在癌旁作用于癌促进肿瘤血管生成的机制。采用慢病毒转染技术构建原代肝前体细胞m HPC及肝前体细胞系BNLCL2的Bmi1过表达细胞株,观察细胞株较未处理组的增殖转移能力的变化以及可能的分化方向。采用CCK-8实验检测细胞株的增殖活性,通过克隆形成实验检测细胞的集落形成能力,经由transwell实验检测细胞的转移侵袭能力。利用Real-time PCR与Western-Blot及细胞免疫荧光技术检测Bmi1过表达肝前体细胞株及其对照细胞株的干性标志物CD133及SOX9,胆系标志物CK7以及纤维化指标α-SMA的表达情况。使用小鼠肝癌细胞的培养上清和缺氧培养条件处理两种过表达Bmi1的肝前体细胞及其各自对照组细胞,应用Elisa试剂盒检测每组肝前体细胞培养上清中的VEGF水平,并经由Real-time PCR检测肝前体细胞的VEGF m RNA的表达水平明确Bmi1经由肝前体细胞促进肝肿瘤的血管生成的作用。为在体内水平进一步验,将过表达Bmi1的肝前体细胞株和小鼠肝癌细胞混合,于裸鼠皮下注射构建皮下荷瘤模型,使用对照肝前体细胞株同样混合处理作为对照模型,3周后拍照取瘤并使用免疫组化评估MVD水平,使用Real-time PCR筛选两组间表达可能有差异的血管生成相关因子,并经由Western-Blot验证。最后使用小鼠肝癌细胞于裸鼠皮下注射构建荷瘤模型,3周后取出皮下瘤块并接种于Bmi1+/-及对照组Bmi1+/+小鼠肝脏构建种植瘤模型,探究癌旁Bmi1对肿瘤相关生物学特性及血管生成的影响。研究结果1.肿瘤数目>1及肿瘤直径>5cm是影响混合型肝癌患者总体生存的危险因素,术中出血>300ml、TNM分期高、PIDR≥50%、癌旁Bmi1高表达(评分为3+)、MVD>60/mm2是影响患者术后总体生存的独立危险因素;2.混合型肝癌患者MVD与癌旁Bmi1及PIDR表达水平相关,癌旁Bmi1与PIDR表达水平显著相关;3.Bmi1过表达可提升肝前体细胞的增殖及转移能力;4.Bmi1可促进肝前体细胞的活化,增加胆系标志物CK7、纤维化指标α-SMA及干性标志物CD133及SOX9的表达;5.Bmi1可促进肝前体细胞血管生成相关细胞因子b FGF、VEGFA、VEGFC的表达。结论临床数据统计以及免疫组化评估分析发现癌旁Bmi1及HPC的活化与肝癌患者的肿瘤血管生成水平及预后密切相关。通过体内外试验的进一步验证发现Bmi1与肝前体细胞的生物学特性密切相关;Bmi1可促进肝前体细胞的活化、增加干性及纤维化标志物的表达;并提示癌旁Bmi1可能通过激活HPC分泌血管生成因子促进肝脏肿瘤的发生发展。