神经红蛋白(Neuroglobin, Ngb)是近期在脊椎动物的神经系统中发现的一种新颖血红素蛋白,它由一条含151个氨基酸的肽链和血红素b组成。在古老脊椎动物珠蛋白的进化过程中,神经红蛋白是最保守的一种,它对氧有固有的不稳定性,在氧存在时亚铁迅速被氧化为三价铁形式。与传统的珠蛋白(血红蛋白、肌红蛋白)所不同的是,在低铁和高铁状态下神经红蛋白中的血红素Fe都是以六配位形式存在,这种新颖结构必将赋予其新的功能。目前研究表明,神经红蛋白可能的生物学功能有氧载体、酶功能、对NO的解毒作用、作为氧传感器和保护神经元免受缺氧/缺血损伤,但对其具体的生物学功能尚不清楚。　　定点突变已成为基因工程及蛋白质工程中广泛应用的实验手段。通过对突变体蛋白与野生型蛋白性质的比较,可以鉴别出对蛋白质的结构和生物学功能至关重要的结构域或个别氨基酸残基,进而阐明蛋白质的结构、性质与功能间的关系。　　44位酪氨酸(CD3)位于Ngb的C、D螺旋之间,与血红素heme上的一个丙酸根之间距离2.637?,且与血红素第六配体His64距离较近,因此,Tyr44的改变可能会影响蛋白质的疏水腔、血红素与肽链的结合能力以及蛋白质的稳定性;64位组氨酸(E7)位于Ngb的E螺旋区段中,是heme的第六配体,它的突变将改变heme的配位数,减弱heme与肽链之间的结合力;95位赖氨酸(F7)位于 Ngb的 F螺旋终端,紧靠着heme的近端配体His96,且与heme上的丙酸根距离较近,它的改变可能影响到Ngb的表面性质,进而影响到 Ngb的空间结构。本文选择了以上几个氨基酸残基作为突变位点,设计了Tyr44Phe(Y44F)、His64Gln(H64Q)、His64Val(H64V)、Lys95Ser(K95S)和 Lys95Leu(K95L)五个突变体蛋白,目的是改变蛋白质疏水腔中的氨基酸残基、血红素轴向配体和表面的极性氨基酸,因为它们可能对血红素与肽链之间的结合力和蛋白肽链的折叠方面起到重要作用。　　利用PCR介导的定点突变方法得到了突变体基因,DNA序列分析结果验证了基因的正确性。将带有突变基因的pET3a质粒转入大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)plys中,突变体蛋白得到成功表达,经破菌、硫酸铵沉淀、FPLC系统纯化得电泳纯蛋白。同野生型Ngb一样,突变体蛋白在缺氧条件下表达量增加,突变体蛋白Y44F、H64Q、H64V、K95S和K95L的产率分别为8 mg/L、6 mg/L、6 mg/L、8 mg/L和8 mg/L左右,与野生型Ngb相比(12 mg/L)均有所降低。　　电喷雾质谱测得的蛋白质分子量与理论值一致,验证了突变体蛋白的正确性。紫外可见吸收、荧光和圆二色光谱研究表明,Tyr44、His64和Lys95的突变对血红素的疏水环境有一定影响,使荧光基团暴露于极性环境,影响了蛋白二级结构的相对含量;并且突变体H64Q和H64V的Soret峰位由413 nm蓝移至406 nm,表明His64的突变改变了血红素的六配位方式。　　神经红蛋白及其突变体对酸的稳定性研究表明,在pH>4.0时,它们可以稳定存在,当酸度继续增加时,Soret吸收峰值明显降低,部分血红素脱离蛋白肽链;使荧光基团更加暴露于极性环境,荧光强度显著增加;酸性溶液可以破坏蛋白的二级结构。由于蛋白质分子内氢键、静电和疏水相互作用,酸致变性并不彻底。神经红蛋白及其突变体在酸中的稳定性顺序为:Ngb>K95S>K95L>Y44F>H64V>H64Q。　　神经红蛋白及其突变体的热变性过程中,Soret吸收峰值随温度的升高逐渐降低,峰位发生蓝移,并且有一等吸收点,说明蛋白的热变性符合两态模型。结果表明,Ngb是一个高热稳定性蛋白,在温度接近100°C时,血红素仍没有脱离蛋白肽链,变性没有达到平衡。Tyr44和Lys95的突变对蛋白整体结构影响不大,热稳定性稍有降低;轴向配体His64的突变使heme与蛋白肽链之间的结合力大大减弱,蛋白的热稳定性大大降低。热变性对蛋白的二级结构影响较大,野生型 Ngb及其突变体蛋白的?-螺旋含量都有不同程度的降低。热稳定性顺序为:Ngb>K95L?Y44F>K95S>H64V>H64Q。　　尿素变性研究表明，神经红蛋白在尿素中相当稳定,即使尿素浓度达到9 mol/L时,变性也不完全。从血红素脱离蛋白肽链的程度、荧光基团所处微环境和蛋白二级结构的变化分析方面来看，神经红蛋白及其突变体的稳定性顺序均为:Ngb>K95S>K95L? Y44F>H64V>H64Q。用?-巯基乙醇还原分子内二硫键后,野生型Ngb及其突变体蛋白Y44F、K95S和K95L对尿素的抵抗力有所降低,说明二硫键的存在使无序的蛋白链CD-D区变的相对有序,对该蛋白的结构具有稳定作用。出乎我们意料的是,当突变体蛋白H64Q和H64V分子内二硫键破坏后,它们对尿素的抵抗力有所增加,但仍低于其它突变体蛋白。尿素诱导的神经红蛋白及其突变体去折叠的荧光相图分析表明,它们在尿素中的去折叠符合“三态模型”,而非简单的“两态模型”,定点突变并没有明显影响Ngb在尿素中的变性机理。　　盐酸胍由于具有离子特性,比尿素的变性能力强,Ngb及其突变体在盐酸胍中的变性较为彻底。在较高盐酸胍浓度下,血红素从疏水腔中脱出,荧光基团暴露于极性环境,蛋白肽链伸展。它们在盐酸胍中的稳定性顺序为:Ngb>Y44F>K95S>K95L>H64V>H64Q。荧光相图分析表明,Ngb的盐酸胍变性是一个非常复杂的过程,它至少包括五种不同的构象态。定点突变不仅可以改变蛋白质的稳定性,还可以改变其变性中间过渡态,影响蛋白质的去折叠过程。用?-巯基乙醇还原分子内二硫键后,野生型及其突变体在更低浓度的盐酸胍溶液中就发生了去折叠,说明二硫键在稳定蛋白结构上起着重要的作用。同样,突变体蛋白H64Q和H64V分子内二硫键被破坏后,它们对盐酸胍的抵抗力有所增加,但仍低于其它突变体蛋白。　　测定了突变体蛋白H64Q和H64V的过氧化物酶催化活性,并与野生型Ngb的酶活性进行了比较。在pH=7.0时,突变体H64Q和H64V的酶催化活性最大,且远远高于野生型Ngb。在H2O2浓度0.5-8 mmol/L范围内,H64Q和H64V的酶催化活性与H2O2的浓度呈线性关系,在H2O2浓度大于8 mmol/L后,反应速率开始趋于稳定;而野生型Ngb的酶催化活性随H2O2浓度的增加而增加,但仍低于突变体蛋白的酶催化活性。结果表明,突变体H64Q和H64V的过氧化物酶活性较野生型Ngb有很大提高,它们的表观二级常数分别为Ngb的301倍和389倍。这是由于突变体蛋白H64Q和H64V中heme空出了第六配体,提供了一个可以供底物分子结合的位点,便于底物分子进入heme的空腔,因此其催化活性增加。　　利用紫外可见吸收、荧光和圆二色光谱法详细研究了神经红蛋白在甲醇和乙醇中的去折叠和再折叠过程。结果表明,乙醇的变性能力比甲醇强,醇引起的蛋白质去折叠是一个协同过程,即血红素从疏水腔内脱出,同时伴随着蛋白质二级和三级结构的变化,蛋白质发生去折叠。由乙醇引起的蛋白构象上的变化是可逆的,去折叠和再折叠的路径基本相同,但在甲醇中去折叠和再折叠的路径不完全相同。不过蛋白在醇中的再折叠最终都回到了天然态,只是血红素的结合存在滞后现象。