研究的目的和意义通过显微镜、利用目视方法来分析免疫组化染色结果在临床病理学及生物医学工程学中一直占有重要的地位，由于该法具有一定的主观性，因而影响了结果分析与判断的准确性。随着计算机技术的发展，计算机图像处理与分析技术在临床诊断和治疗中起着越来越重要的作用。开发新的图像分析系统（IAS），用计算机来自动处理免疫组化细胞图像，进行定量分析，辅助医生做出快速准确的判断在医学疾病诊断上有重要应用前景。但目前的图像分析系统的准确率还不够高，要得到好的分类、分析效果或较高的识别率，要获得精确定量化特征参数，依赖于准确、快速并具可重复性的分割技术，换句话说，分割处理是IAS中的关键环节。但由于图像分割面向问题的特殊性，至今尚未有一个普遍适用的理论和方法。数学、计算机技术、体视学及医学相关领域的飞速发展为细胞的自动分割和定量分析奠定了基础。研究相关的分割分离技术，为高效实用的病理图像辅助分析系统奠定技术基础成为当前研究的热点。研究内容与拟解决的问题从CCD摄像机输出的免疫组化细胞图像是真彩色图像，其中阳性细胞和阴性细胞的计数以及它们之间的比例是判断免疫组化反应强度的重要指标，对肿瘤的诊断和预后判定有非常重要的价值。为了能够对免疫组化细胞图像进行准确的数据分析，关键是要对该种图像中的阳性细胞和阴性细胞进行正确地分割。免疫组化彩色图像中，阳性细胞和阴性细胞在RGB三个颜色空间都有交叉区，因而单纯从某个颜色空间来分割阳性细胞和阴性细胞几乎不可能。此外由于切片、涂片和细胞本身的原因，经常会出现多个细胞重叠在一起形成一个较大的融合区域，如果不能有效地把重叠在一起的细胞分离成单个细胞，这将直接影响细胞计数和各种参数的测量结果。本论文针对免疫组化细胞图像的特点，提出免疫组化融合性图像特征结构的分割技术与重叠细胞图像的自动分离技术，解决阳性细胞和阴性细胞分割提取，细胞重叠判定、细胞核心计算、重叠细胞分离等技术难题。免疫组化融合性图像特征结构分割技术研究的内容是对具有闭合连续边界属性的彩色细胞图像进行新的分割方法的设计与实现，并做图像分割实验，提取出免疫组化彩色图像中的阳性细胞和阴性细胞。目的是获得更准确而快速的彩色细胞图像分割方法，用以提高彩色图像中特定区域的识别和测量精度。重叠细胞图像的自动分离技术研究的内容是对重叠在一起的细胞图像进行新的分离算法的设计与实现，目的是获得边界完整、无破损的单个细胞，为细胞的计数和面积、周长及形状因子等参数的定量测试奠定基础。技术路线1．免疫组化融合性图像特征结构的分割（1）图像预处理包括图像对比度的增强、噪声的滤除、图像内部空洞的填补等，用于提高图像的质量，便于区域的识别。（2）色度学分析采集多幅ER／PR免疫组化彩色图像，分析不同区域的RGB三色空间的颜色值，获得阳性细胞和阴性细胞在RGB三色空间的分布概况，寻找阳性细胞和阴性细胞RGB分布差异。（3）阳性细胞和阴性细胞的粗分割依据色度学分析的结果，建立免疫组化彩色图像色度学判断准则，对阳性细胞和阴性细胞粗分割。（4）阳性细胞和阴性细胞的细分割选择合适的分割算法——C均值聚类，针对其不足进行改进，形成新的细胞分割算法。（5）在Matlab6.1的环境下编程实现本技术。2．重叠细胞分离（1）细胞重叠区域的检出采集一些形状各异的细胞和重叠细胞，测量它们的体视学参数，获得有意义的结果，用于对阳性细胞和阴性细胞区域内的每个连通区进行判别，是否存在细胞重叠。（2）细胞核心计算分析单个细胞的核心，建立重叠细胞中各个细胞核心的计算方法。（3）重叠细胞凸闭包结构分析对细胞重叠区域的凹凸性进行分析，计算凸闭包结构，并基于凸闭包计算重叠细胞的凹区。（4）凹点搜寻对重叠细胞凹区分析，从重叠细胞凹区搜寻到凹点。（5）重叠细胞分离针对不同形状的重叠，从分离区中搜寻精确的分离点，连接分离点对实现细胞分离。（6）在Matlab6.1的环境下编程实现本技术。创新点1．在免疫组化融合性图像特征结构分割技术的研究方面（1）免疫组化色度学准则本文通过对免疫组化彩色图像的色度学分析，首次提出了一套用于免疫组化真彩色图像分割的色度学准则，即：①正向扫描整幅图像，将每个像素的R分量减去B分量，根据其差值是否大于0将像素分为两大类：（R-B）＞=0类和（R-B）＜0类。②在（R-B）＞=0类中，凡是（R-B）＞=0的像素令其保留原先的颜色值，而（R-B）＜0的像素则令其为黑色，这样得出的图像A除去了阴性细胞。③在（R-B）＜0类中，凡是（R-B）＜0的像素令其保留原先的颜色值，而（R-B）＞=0的像素则令其为黑色，这样得出的图像B除去了阳性细胞。该准则能将阳性细胞和阴性细胞粗分割开来，使得两类细胞分别位于不同的图像内——图像A和图像B。图像A和图像B相比原始图像，复杂度降低。（2） C-均值算法改进在色度学准则的基础上我们建立了一种基于改进C均值聚类算法的免疫组化彩色图像分割算法，其思想是：①分别在图像A的R分量上运行C均值聚类算法，在图像B的B分量上运行C均值聚类算法。这样处理之后，将原图像从三维色度学空间（R、G、B空间）减少到一维色空间，大大减少了C-均值聚类分割的数据量，提高了1／3的运算速度。②在样本数量相同的基础上，初始聚类中心影响着聚类的迭代次数和聚类的准确性。本文根据图像A和图像B背景相似的特征，先对图像A聚类分割，提取出阳性细胞后，将得到的聚类中心作为图像B的初始聚类中心，再对图像B聚类。③根据每次迭代过程中，聚类中心的变化趋势来预测下一次迭代后可能的聚类中心，计算公式如下：divC_2n=C_2n-C_2n-1C_2n+1=C_2n+divC_2n经过上述处理，能减少约1／5的迭代次数，从而加快聚类的速度。2．在重叠细胞分离技术的研究方面重叠细胞分离技术是在提出以下新方法的基础上逐步完成的。（1）首次提出并建立了基于形状因子分析的重叠细胞判别方法。其基本思想是：根据不同粒子形状因子的计算结果分析，提出重叠细胞形状因子的阈值PO=0.5：当PE＜=PO，认为目标存在细胞重叠；PE＞PO，认为目标不存在细胞重叠。该方法能够将细胞图像中的重叠区域检出。（2）首次提出并建立了基于数学形态学的重叠细胞核心提取技术。其基本思想是将细胞边界一层层腐蚀，直至分离成单个细胞，之后提取出重叠细胞区域中各个细胞的核心。（3）首次提出并建立了基于凸闭包结构的凹区提取方法。其基本思想是：分析凹图形轮廓上每点的位置关系，从凹图形轮廓上寻找到所有的凸集点，将这些点连接形成凸闭包图形，并由凸闭包和凹图形的差值获得凹区。（4）首次提出并建立了基于凹区的凹点搜寻方法其基本思想是：对于细胞串联的情况，通过搜索位于异侧的凹区对且距离局部最小的两个点构成凹点对，并提出了三个以上的细胞串联情况下凹区配对法则，即：如果存在两个凹区M_k1和M_k2，与核心O_j1和O_j2的距离差最小，公式如下，则这两个凹区是配对的，从这两个凹区可以搜索到凹点。|M_k1O_j1—M_k1O_j2|=min{|M_k1O_j—M_k1O_j|}|M_k2O_j1—M_k1O_j2|=min{|M_k2O_i—M_k2O_j|}式中，j1≠j2，i≠j，且j1，j2，i，j≤n_j，n_j为核心的个数。对于细胞并联的情况，首先计算出重叠细胞区域的中心点坐标，然后计算每个凹区和重叠细胞中心点之间的最短距离，该值所对应的凹区上的点为并联细胞的凹点。（5）首次提出并建立了基于凹点搜寻的细胞分离技术。在上述研究的基础上，本文根据重叠细胞分离点对的特点，提出并建立了基于凹点搜寻的重叠细胞分离新技术，其思想是：首先判断细胞是否重叠，如果重叠则提取图像中的重叠区域；计算重叠细胞核心的坐标，并由核心的个数判断细胞的个数。如果细胞的个数大于等于2，则再次判断为细胞重叠，否则不存在细胞重叠；提取重叠细胞的凹区，从凹区中寻找到凹点，根据凹点数与细胞个数的关系，判断重叠细胞是串联还是并联：如果是串联，则直接将成对的凹点连成直线分离重叠区域；如果是并联，则将凹点与重叠区域的中心点连接成直线分离重叠区域。结果1．免疫组化融合性图像特征结构的分割在Matlab6.1环境下将本技术应用于实际的ER、PR免疫组化彩色图像的分割，能将阳性细胞和阴性细胞分别提取出来，得到较满意的结果。该技术可以应用于我们已经建立的免疫组化染色阳性单位测试方法对免疫组化染色显色反应强度的定量，为免疫组化彩色图像的定量分析提供了一种有价值的辅助手段。不足之处是：分割提取的阳性细胞和阴性细胞存在细胞重叠的情况。这个问题在重叠细胞分离技术中得到解决。2．重叠细胞区域的自动分离（1）基于形状因子分析的重叠细胞判别在Matlab6.1环境下，将重叠细胞判别技术用于实际免疫组化图中的重叠细胞识别，实验结果证明本算法能检测出不同形状的重叠细胞，准确率为95％。本技术不仅可以自动识别出免疫组化细胞图像中的重叠区，并且能计算出图中重叠区域的总个数。不足之处是：如果单个细胞呈现狭长型或凹凸不平，则有可能被误判为重叠细胞。这个问题可以在本文提出的核心提取方法中解决。（2）基于数学形态学的重叠细胞核心提取本技术能提取出重叠区每个细胞的核心，并与利用Windows2003画图工具半自动提取的核心坐标进行比较，结果证明本方法正确，数据可靠，效果满意。不足之处是：如果细胞重叠比较紧密或者细胞重叠在一起时不产生凹陷，有可能得到的核心个数少于实际的核心。任何一个算法都有它的局限性，本技术计算核心的前提是细胞重叠在一起时需要一定的凹陷特征。对于这类特殊的重叠细胞，在程序中应借助鼠标来半自动地提取核心。（3）基于凸闭包结构的凹区提取本技术实现了对不同凹图形的凹区提取，与利用Windows2003的画图工具半自动提取的凹区进行比较：分析计算凹区个数，凹区面积和周长，结果表明基于凸闭包结构的凹区提取技术可靠且效果良好。不足之处是：如果细胞重叠时基本上没有凹陷，则提取不出凹区。这种情况不适合本研究。（4）基于凹区的凹点搜寻本技术实现了在细胞串联和细胞并联的情况下，提取出位于凹区上的凹点。与手工提取的凹点坐标进行比较，结果证明本技术提取的凹点位置准确。（5）基于凹点搜寻的细胞分离本技术在上述研究的基础上，将串联细胞的凹点对连成直线或将凹点与并联重叠区域的中心点连成直线，用来分离串联细胞和并联细胞。与手工分离重叠细胞的效果进行比较，本技术分离后的细胞形态和大小与手工分离的基本一致。不足之处：对算法的执行效率以及针对复杂细胞图像的分离，还有许多待研究的工作。结论1．本研究首次提出并建立了免疫组化色度学准则，可以将ER／PR免疫组化彩色图像中的阳性区和阴性区分割到不同的图像中，为下一步阳性细胞和阴性细胞的分割提取奠定了基础。2．本研究对C-均值算法进行了改进：在色度学准则分割效果的基础上，减少了聚类分割的数据量，并减少了迭代的次数，提高了运行的速度，准确分割提取出免疫组化图像中的阳性细胞和阴性细胞，效果满意。3．本研究首次提出并建了基于形状因子分析的重叠细胞判别新技术，实现了图像中重叠细胞区的自动判别。该技术可用于细胞图像中重叠细胞的自动提取、重叠细胞核的自动提取。4．本研究首次提出基于数学形态学的细胞核心概念及提取技术，计算出重叠细胞的各个核心坐标以及总的核心数。该技术可用于重叠细胞的自动分离、细胞散点图的构建。5．本研究首次提出并建立了基于凸闭包结构的凹区提取技术，从重叠细胞的凹凸性方面计算出重叠细胞的各个凹区。该技术可用于重叠细胞的自动分离、细胞异型性的判别。6．本研究首次提出并建立了基于凹区的凹点搜寻新技术，将重叠细胞的各个凹点提取出来，为细胞的分离奠定基础。7．本研究在3-6技术方法的基础上，首次提出了基于凹点搜寻的重叠细胞分离技术，实现了串联和并联细胞的自动分离。该技术可用于细胞参数的定量。