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背景帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种神经退行性疾病,临床表现以静止性震颤、运动迟缓、肢体强直和姿势平衡障碍为主。其病理特征是中脑黑质致密部(Substantia nigra pars compacta,SNpc)中的多巴胺能神经元选择性变性[1,2]和神经元内错误折叠的α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)沉积导致路易小体/路易神经突(LBs/LNs)形成[3-5]。研究发现,很多散发性和家族性PD患者大脑中都存在α-Syn阳性包涵体沉积[6],但是其中的病理学过程仍不清楚[7,8]。错误折叠的α-Syn选择性分布于中枢神经系统的特定区域及细胞群,其分布区域与临床症状有密切相关[9]。但迄今为止,错误折叠的α-Syn沉积与中脑黑质中多巴胺神经元变性丢失之间的确切关系仍存在争议。许多种PD的动物模型已广泛用于研究神经退行性疾病的发病机理。其中,1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的动物模型是模拟PD的经典实验动物模型。MPTP属于一种脂溶性毒素,可顺利快速地透过血脑屏障,通过氧化应激和抑制线粒体呼吸链的方式,选择性的杀死黑质纹状体中的多巴胺能神经元[10]。该模型可以很好地模拟PD患者的运动障碍症状,但不足之处是脑内缺乏α-Syn阳性包涵体沉积的病理特征。过表达人类α-Syn的转基因动物模型存在PD的部分病理特征,如多巴胺能神经元内有α-Syn沉积、多巴胺神经元的进行性丢失等。但是,该模型自身都具有固定的遗传背景,而PD大多为散发性疾病。因此,在无遗传基因改变的背景下,研究α-Syn病理在动物模型中播散的过程是对PD发病机制研究的关键。研究证明,错误折叠的α-Syn聚集体可以像“阮蛋白”一样,在脑组织中作为“种子”诱导正常的α-Syn发生异常折叠,并从一个细胞播散到另一个细胞[11,12]。且在体外研究中,往野生型小鼠原代神经元中注入外源性α-Syn预制纤维体(Pre-formed fibrils,PFFs)可以导致α-Syn阳性包涵体沉积,并诱导内源性α-Syn发生错误折叠[13,14]。本课题将以野生型C57BL/6J小鼠为研究对象,单侧纹状体内注射鼠源性α-Syn PFFs,构建PD小鼠模型,研究错误折叠的α-Syn的病理播散途径及其所诱导的小鼠行为学表型。目的本项研究以野生型C57BL/6J小鼠为研究对象,利用立体定位注射技术,在小鼠右侧纹状体内注射鼠源性α-Syn PFFs,构建PD野生型小鼠模型,研究α-Syn阳性包涵体的播散及所诱导的小鼠行为学表型。方法1.预制α-Syn纤维体,并在透射电子显微镜下观察其形态。2.利用立体定位技术,向小鼠右侧纹状体内注射α-Syn PFFs 5μL。分别在注射后的第30天、90天及180天三个时间点,对小鼠进行灌注取材、观察小鼠脑组织切片中的磷酸化α-Syn病理。3.通过组织免疫化学染色法,观察取材组织的α-Syn病理学表现;通过组织免疫荧光染色法,观察黑质中多巴胺神经元及脑桥中星形胶质细胞的数量变化。4.通过转棒试验、挂线试验和悬尾试验,观察记录并统计分析小鼠的行为学数据变化。结果1.利用透射电子显微镜,观察到超声波处理后破碎的α-Syn PFFs直径测量值为67.56 ± 41.86 nm,呈现较少交叉纠缠的状态。2.在鼠源性α-Syn PFFs注射后30天,实验组小鼠的脑组织切片中的磷酸化的α-Syn病理主要分布于右侧纹状体、右侧黑质、右侧杏仁核、右侧皮层,呈浅淡的棕色LBs/LNs样病理。在鼠源性α-Syn PFFs注射后90天,实验组小鼠的双侧的杏仁核均观察到了磷酸化α-Syn病理。在鼠源性α-Syn PFFs注射后180天,实验组小鼠的右侧纹状体、右侧黑质、右侧杏仁核、右侧皮层观察到分布于细胞核周为主的,棕褐色的颗粒状、斑块状的LBs病理。相反,在注射PBS对照组的小鼠脑组织切片内,从未观察到磷酸化α-Syn病理。3.注射鼠源性α-Syn PFFs后30天、90天、180天,实验组小鼠右侧黑质中TH免疫反应阳性区域分别为(19.01±3.09)%Area、(13.93± 1.60)%Area、(9.78±1.81)%Area。采用单因素方差分析P<0.0001,差异具有显著统计学意义,然后使用Sidak方法进行事后多重比较(PFF 30d vs PFF 90d,P=0.0044;PFF 30d vs PFF 180d,P<0.0001;PFF 90d vs PFF 180d,P=0.0187)。而注射 PBS后180天,对照组小鼠黑质中TH免疫反应阳性区域为(31.04±2.61)%Area,采用两独立样本T检验的方法,与同期注射鼠源性α-Syn PFFs实验组相比(PFF 180d vs PBS 180d,P<0.0001),实验组小鼠右侧黑质中多巴胺能神经元减少约21.26%,差异具有显著统计学意义。4.组织免疫组织荧光结果显示,注射鼠源性α-Syn PFFs后30天、90天、180天,实验组小鼠脑桥切片内星形胶质细胞数量分别为(7.83±1.47)个、(29.67±3.98)个、(49.17±4.22)个,采用单因素方差分析P<0.0001,差异具有显著统计学意义,然后使用Sidak方法进行事后多重比较(PFF 30d vs PFF 90d,P<0.0001;PFF 30d vs PFF 180d,P<0.0001;PFF 90d vs PFF 180d,P<0.0001),差异均具有统计学意义。5.小鼠的行为学统计分析显示,与PBS对照组小鼠相比,随着时间进展,α-Syn PFFs实验组小鼠的肢体运动协调功能、四肢肌力均表现出进行性的恶化,但未出现明显抑郁状态。结论1.小鼠纹状体内注射鼠源性α-Syn PFFs可诱导α-Syn阳性包涵体形成并沿纹状体投射通路进行播散。2.与PBS对照组小鼠相比,随着时间进展,鼠α-Syn PFFs实验组小鼠右侧黑质中的多巴胺能神经元出现进行性的减少。3.随时间进展,α-Syn PFFs实验组小鼠脑桥中星形胶质细胞数量逐渐活化增多。4.小鼠纹状体注射鼠源性α-Syn PFFs可诱导小鼠出现PD样行为学表型。